Для начала центрифугируйте один раз по 10 в степени семи клеточных линий HeLa, содержащих теломерные рестрикционные фрагменты ДНК в дозе 1000 г в течение трех минут. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 200 микролитрах PBS. После обработки SDS протеиназой К и хлоридом натрия центрифугируйте клеточную суспензию при 16 900 г в течение 10 минут.
Перенесите надосадочную жидкость в новую центрифужную пробирку и добавьте равный объем изопропанола, избегая плавающих липидов или осадка. Центрифугируйте на высокой скорости, и промойте гранулу 500 микролитрами 70% этанола. После высыхания гранулы ДНК осторожно ресуспендируйте ее в 475 микролитрах TE-буфера и аккуратно перемешайте, постукивая по дну пробирки.
Теперь добавьте 25 микролитров 10 миллиграммов на миллилитр РНК и постукивайте по тюбику, пока гранула полностью не растворится. Далее добавьте 1/10 объема трехмолярного ацетата натрия и два объема холодного 100% этанола и поместите пробирку при температуре минус 80 градусов Цельсия на два-три часа. После центрифугирования и промывки 70% этанолом добавьте 100 микролитров TE-буфера в гранулу ДНК, постучите по пробирке для смешивания и поместите ее при температуре четыре градуса Цельсия на два часа для полного растворения.
Для расщепления ДНК соедините четыре микрограмма геномной ДНК с одним микролитром CviAII, двумя микролитрами буфера для разложения 10X и водой, чтобы получить общий объем 20 микролитров. Выдерживайте смесь при температуре 25 градусов Цельсия в течение 12 часов. В термоамплификаторе нагрейте смесь до 75 градусов Цельсия в течение трех минут.
Затем снижайте температуру на 0,1 градуса Цельсия каждые 30 секунд до достижения 25 градусов Цельсия. После очистки и высыхания смажьте нижнюю крышку листков 20 микролитрами 0,1% нитроцеллюлозы и добавьте эталонные бусины. Выпекайте крышку при температуре 100 градусов Цельсия в течение четырех минут.
Соберите сэндвич с проточной ячейкой. А после нагрева до 85 градусов по Цельсию с помощью двух тампонов массируйте сборку, пока Парапленка не запечатает канал. Промойте 10 микролитров бусин М-270 пять раз с 50 микролитрами рабочего буфера с помощью магнита.
После промывки добавьте шарики поверх переваренной геномной ДНК в 1,5-миллилитровую центрифужную пробирку. Осторожно переверните пробирку несколько раз, чтобы смешать бусины и образец ДНК. Оставьте смесь на льду на один час.
После инкубации промойте смесь с 500 микролитрами рабочего буфера три раза с помощью магнита, чтобы потянуть шарики вниз с 10-минутными интервалами между стирками. Повторно суспендируйте образец в рабочем буфере, и загрузите 30 микролитров смеси в проточную ячейку. Промойте несвязанные магнитные шарики через 30 минут.
Поместив проточную ячейку на верхнюю часть линзы объектива, выберите пару пятимиллиметровых кубических магнитов, расположенных в вертикальной конфигурации, и совместите держатель магнита с осью X светового пути магнитного пинцета для визуализации. Запустите программное обеспечение для графического программирования и подключите контроллеры для магнитного пинцета. Отрегулируйте поле зрения, чтобы найти эталонный валик в нижней части ячейки потока, и слегка отрегулируйте линзу объектива так, чтобы на эталонном валике были видны четкие кольца преломления.
Напишите скрипт в MATLAB для управления движениями моторики для анализа нарастания силы. Импортируйте сценарий в графическое программное обеспечение для тестирования экспериментов с одной молекулой. При медленном потоке загрузите 200 микролитров 10-наномолярного TRF1 в проточную ячейку.
После 30 минут привязки выберите сценарий для эксперимента с силовым нарастанием со скоростью нагружения плюс/минус один пиконьютон в секунду. Присвойте файлам данных имя и запустите эксперимент. Целостность геномной ДНК была подтверждена с помощью электрофореза в агарозном геле, при этом полученный TRS демонстрирует постоянную длину на различных клеточных линиях человека.
Теломерные повторные последовательности в TRS были обнаружены с помощью южного блоттинга, демонстрируя четкие сигналы гибридизации. Кривые растяжения силы из анализа силового рампы показали зигзагообразные паттерны во время растяжения, указывающие на разрыв взаимодействий белковой ДНК. Кинетика диссоциации белковых комплексов теломерной ДНК показала линейную зависимость между силой и скоростью диссоциации.
Кроме того, гетерогенность по длине теломерной ДНК из клеток человека исследует механизм образования петель в теломерах различной длины.
