Для начала разложите свежеприготовленный фильтр стерилизованный блокирующий буфер, 10X реакционный буфер один и два на рабочую платформу. Поместите открытые пробирки, содержащие 2,5 миллилитра блокирующего буфера и пять миллилитров сверхчистой воды, в эксикатор и дегазируйте под вакуумом. Через 15 минут сбросьте давление и снимите трубки.
Поместите подготовленную сборку проточных ячеек биотин-ПЭГ на предметный столик для микроскопа и закрепите ее с помощью клеевой шпаклевки с каждого конца. Подсоедините выходную трубку проточной ячейки к шприцевому насосу с помощью иглы. Включите обогреватель объектива до 30 градусов Цельсия.
Закрепите один-два миллилитра дегазированной воды в трубке на отдельном куске клеевой замазки рядом с проточной ячейкой. Вставьте входную трубку в трубку до тех пор, пока она не достигнет дна, и протекайте воду по каналу. Увеличьте расход, чтобы удалить все застрявшие пузырьки рядом с впускной трубкой.
Добавьте 100 микролитров дегазированного блокирующего буфера к 20 микролитрам аликвоты одного миллиграмм на миллилитр стрептавидина. Приложите открытую трубку к клеевой замазке. Переведите входную трубку из воды в стрептавидин и запустите поток со скоростью 40 микролитров в минуту в течение двух минут.
Через пять минут смойте избыток стрептавидина блокирующим буфером. Поток в биотинилированной ДНК разбавлен в блокирующем буфере, содержащем 25 наномоляров SYTOX Orange. Изображение можно использовать с помощью лазера с яркостью 532 нанометра для наблюдения за тем, как ДНК привязывается к поверхности в режиме реального времени.
Как только желаемая плотность ДНК на поверхности будет достигнута, введите блокирующий буфер, содержащий 25 наномолярных SYTOX, чтобы вымыть свободную ДНК. Теперь проточные и биотинилированные антидигоксигениновые антитела разведены в блокирующем буфере, содержащем 25 наномолярных антител SYTOX Orange. Промойте биотинилированное антитело к дигоксигенину и SYTOX Orange с блокирующим буфером.
Слейте 50 микролитров смеси АТФ-гамма-S в проточную ячейку. Добавьте очищенную геликазу CMG примерно до 100 наномолярных конечных концентраций в 30 микролитров смеси АТФ-гамма-S и пейте со скоростью 20 микролитров в минуту на 20 микролитров. Выдерживать в течение 15 минут.
Далее вливаем в АТФ смесь РПА со скоростью 40 микролитров в минуту на 80 микролитров. Используя каждый лазер с экспозицией от 50 до 100 миллисекунд, визуализируйте и получите EGFP RPA с помощью лазера с яркостью 488 нанометров, а затем получите CMG с помощью лазера с яркостью 640 нанометров. Наконец, визуализируйте и получите окрашенную ДНК SYTOX Orange с помощью лазера с яркостью 532 нанометра.
Раскручивание ДНК в геликазе CMG визуализировалось по линейному росту желтой RPA, отслеживаемому с течением времени, что указывает на раскручивающиеся нити ДНК. Повреждение одноцепочечной ДНК уменьшало количество наблюдаемых успешных событий раскручивания, о чем свидетельствует меньшее количество полных следов в данных.
