Для начала поместите трансгенную личинку в легкоплавкую агарозу в чашку для микролунок со стеклянным дном. Поставьте чашку на микроскопический предметный столик в инвертированный микроскоп. Расположите и сфокусируйте нужную область для абляции в центре поля зрения.
Выберите настройки Z-стека, чтобы отобразить всю ширину операции. Сфотографируйте интересующую область оперкулы перед абляцией. Затем нарисуйте круглую область диаметром 25 микрометров в выбранной 2D-плоскости.
Сосредоточьтесь на операции с помощью инструмента «Область интереса» или ROI. Чтобы выполнить абляцию, примените измеренную без объектива мощность абляции до 450 милливатт в течение 10 секунд. Подвергните выделенную область воздействию двухфотонного лазера.
После абляции подтвердите абляцию структурно, визуализировав тот же Z-стек с теми же настройками, что и до абляции. С помощью щипцов или иглы для вскрытия аккуратно извлеките личинки из легкоплавкой агарозы. Сначала снимают слой агарозы, покрывающий личинки.
Во-вторых, удалите агарозу при непосредственном контакте с личинками. Поместите личинок обратно в миску с чистой средой Е3. Через четыре или шесть часов после поражения повторно визуализируйте область оперкулы с использованием личинок, встроенных в агарозу, с теми же настройками на том же микроскопе.
После обработки изображений на Фиджи количественно определите ячейки с помощью ядерной метки или путем измерения площади, если ячейки перекрываются. Чтобы количественно оценить площадь, создайте маску, охватывающую макрофаги. Используйте инструмент «Изображение, настройка, порог», «Создать ROI» и проанализируйте частицы.
Затем измерьте площадь. Создавайте графики с отображением результатов измерений с помощью подходящего программного обеспечения. Значительное накопление макрофагов в области абляции было обнаружено через шесть часов после абляции у личинок через шесть дней после оплодотворения.
У личинок через четыре дня после оплодотворения количество макрофагов увеличивалось через четыре часа после поражения. Количество и площадь макрофагов увеличились через четыре часа после поражения по сравнению с неабляционным состоянием.
