Для начала извлеките из инкубатора культуральную пластину, содержащую взрослых гермафродитных самок червей. После синхронизации червей him-5, промойте червей пять раз буфером M9. Перенесите однодневных взрослых самцов из засеянного планшета в пробирку, содержащую буфер М9.
Поместите червей на незасеянную пластину NGM, чтобы устранить остаточные бактерии и предотвратить помехи от пищи во время анализа. Приготовьте планшет для хемоаттракционного анализа с 1,5%-ным шнеком, 25 ммиллимолярным хлоридом натрия, 1,5 млимолярным трис-основанием и 3,5 млимоляром трис гидрохлоридом. Нагрейте шнек в растворе хемоаттракции в микроволновой печи до полного растворения.
После охлаждения с помощью пипетки равномерно распределите раствор шнека хемоаттракции по чашкам Петри. Оставьте крышки открытыми в чистом месте, чтобы поверхность шнека слегка подсохла. Как только поверхность высохнет, закройте крышки.
Чтобы провести анализ хемоаттракции, отметьте три отдельных пятна на крышке и нижней стороне чашки Петри. Нанесите по два микролитра одного молярного азида натрия на каждую экспериментальную и контрольную точку на пластине. Соберите 20 здоровых и свободно передвигающихся самцов червей с помощью червечника.
Под препарирующим микроскопом выпустите червя в начальной точке. Быстро добавьте два микролитра буфера M9 в контрольное пятно и два микролитра полового феромона в экспериментальное пятно на крышке. Аккуратно закройте крышку и поставьте тарелку в тихое, стабильное по температуре место.
Через 30 минут оцените анализ, подсчитав количество червей в каждом месте. Для более точной оценки хемотаксиса запишите траектории червей с помощью камеры. Индекс хемотаксиса для самцов he-5 был постоянно выше 0,5, что указывает на сильное влечение к источнику половых феромонов, в то время как индекс хемотаксиса для самцов SRD-1 был около нуля.
Успешные анализы хемоаттракции показали, что самцы со временем приближаются к источнику феромонов, с цветовой кодировкой траекторий, указывающих время, расстояние, скорость, прямолинейность и правильность направления.
