Для начала получите многоракурсные изображения эмбрионов рыб данио-рерио на ранних стадиях с помощью светового листового микроскопа. Как только процентные точки будут обнаружены, выберите все представления, щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Зарегистрироваться с использованием процентных баллов». Чтобы проверить, насколько точно сработала регистрация, выберите два последовательных вида.
Перейдите к перекрывающейся области и переключайтесь между двумя видами, чтобы увидеть, накладываются ли друг на друга бусины, изображенные под разными углами. После успешной регистрации нажмите «Сохранить» в окне многовидового проводника, чтобы сохранить обновленный XML-файл. Теперь раскройте бусину.
XML в текстовом редакторе по выбору и скопируйте весь блок в разделе просмотра регистраций. Откройте эмбрион. XML и замените блок регистраций просмотра на блок, скопированный из файла бисера.
Затем откройте зародыш. XML в Big Stitcher и внимательно проверьте, успешно ли прошла регистрация для эмбриона. Повторите то же самое для бусин, проверяя перекрытие интересующих структур в каждых двух последовательных видах.
Чтобы выполнить деконволюцию нескольких ракурсов, выберите все виды в файле бисера, щелкните правой кнопкой мыши и выберите функции разброса точек и параметры извлечения. Перейдите к функциям спреда по умолчанию и нажмите OK. Затем повторно сохраните XML-файл. Далее откройте зародыш.
XML и назначьте функцию спреда точек для каждого вида отдельно. Щелкните правой кнопкой мыши вид, выберите «Функции распределения точек», выберите «Назначить» и выберите «Дополнительно», а затем «Назначить новый PSF всем выбранным видам». Нажмите «Обзор», перейдите к пути к XML-файлу и откройте папку PSF.
В выбранном виде выберите функцию сопоставления спреда точек с соответствующим идентификатором и нажмите OK. После того, как функция разброса точек будет назначена для всех видов, щелкните правой кнопкой мыши и выберите деконволюцию нескольких ракурсов. Выберите ограничивающую рамку в качестве выбранных в данный момент видов. При 70% эпиболии эмбрионы принимали горизонтальную, вертикальную или косую ориентацию внутри полимерной трубки, при этом горизонтальная была наименее представлена, в то время как вертикальное и косое положения наблюдались в равной степени.
Когда образцы были подготовлены перед гаструляцией, около 25% эмбрионов демонстрировали горизонтальную ориентацию. Остальные эмбрионы демонстрировали различные другие ориентации на стадии зачатка. Однако многие из них переориентировались в горизонтальное положение во время раннего формирования сомитов.
Сравнение изображений, полученных в клеточном масштабе, не показало существенной разницы в информации о ядрах, но клеточные границы были лучше разрешены при 30-градусном наборе. По сравнению с исходными входными изображениями, сегментированные изображения содержали ошибки. Программное обеспечение либо не смогло обнаружить границу ячейки, либо нарисовало несуществующие границы клеток.
Количество ошибок резко увеличило получаемые при визуализации изображения с угловыми интервалами 45 и 60 градусов по сравнению с 30 градусами.
