Для начала приготовьте наночастицы двухцепочечной РНК хитозана для кормления личинок тутового шелкопряда. Затем выберите свежелинявших личинок шелкопряда пятого возраста аналогичного размера для эксперимента по кормлению. Поместите каждую личинку по отдельности в лунку шестилуночной пластины.
Накройте тарелку крышкой и морите личинок голодом в течение 24 часов. Далее промойте свежие листья шелковицы деионизированной водой и обсушите их с помощью чистой кухонной бумаги. Полностью высушенные листья разрежьте на диски из листьев размером один сантиметр на один сантиметр.
Перед применением растворите наночастицы дцРНК хитозана в воде, не содержащей нуклеаз, в концентрации 500 нанограмм на микролитр. Покройте 10 микролитрами наночастиц дцРНК хитозана, контролируют наночастицы хитозана и отдельно обнаженную дцРНК на поверхности каждого диска листьев шелковицы. Дайте растворам высохнуть на воздухе на листовых дисках при комнатной температуре в течение пяти минут.
Затем предлагайте каждому личинке каждый день по одному листовому диску, покрытому наночастицами или покрытым дцРНК. Как только покрытый покрытием листовой диск будет полностью съеден личинками, каждый день приносите свежие листья шелковицы. На шестой день поместите личинок на лед, пока они не станут неподвижными.
Чтобы препарировать личинки, отрежьте грудную клетку ножницами на чистой чашке Петри и с помощью пинцета вытащите среднюю кишку. После удаления содержимого. Вымойте среднюю кишку в чашке Петри водой, не содержащей нуклеаз.
Заморозьте среднюю кишку при температуре минус 70 градусов Цельсия в тубе объемом 1,5 миллилитров. Скармливание наночастиц дцРНК хитозана шелкопрядам привело к снижению уровня транскрипта BmToll9-2 на 79% по сравнению с контрольной терапией. Личинки тутового шелкопряда, обработанные наночастицами диРНК хитозана с подавлением BmToll9-2, были заметно меньше, чем у личинок контрольной группы.
Коконы молчаливых личинок BmToll9-2 также были значительно меньше, чем у контрольной группы.
