Чтобы получить макрофаги из костного мозга взрослой мыши дикого типа, поместите клетки костного мозга в 96-луночный оптически обработанный планшет с плоским дном, содержащий DMEM с добавлением 10% FBS и 10% LCCM. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 7% углекислым газом в течение 10 дней. После дифференцировки пипеткой ввели 75 микролитров суспензии Mycobacterium abscessus в лунки, содержащие макрофаги.
Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 7% углекислым газом в течение четырех часов. С помощью микропланшетного дозатора реагентов, оснащенного небольшой кассетой, добавьте 110 микролитров DMEM с добавлением 10% FBS и 10% LCCM в составы или колонки контроля растворителя. Диспонируйте еще 104 микролитра DMEM с добавлением 10% FBS и 10% LCCM в колонки с наибольшей концентрацией соединения или растворителя.
Теперь пипеткой внесите 5,9 микролитров соединений или растворителей в предназначенные для них лунки в колонках. С помощью многоканальной микропипетки выполните два последовательных разведения для каждого соединения и растворителя. После последнего разведения отбросьте лишние 110 микролитров среды из последней лунки.
Добавьте 110 микролитров DMEM с добавлением 10% FBS и 10% LCCM во все колонки, исключая глухие лунки. Приготовьте раствор кларитромицина в концентрации два микрограмма на миллилитр в ДМЭМ. После инкубации извлеките из инкубатора 96-луночный планшет, содержащий зараженные макрофаги.
С помощью пластинчатой моечной машины трижды промойте клетки 200 микролитрами раствора для промывки инфекции. Перенесите 200 микролитров соединений на пластину, содержащую инфицированные макрофаги. Затем добавьте в соответствующие лунки 200 микролитров дополненной среды для клеточных культур и раствор кларитромицина.
Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия с 7% углекислым газом в течение 48 часов. После инкубации промойте зараженные клетки три раза каждая 200 микролитрами промывочного раствора соединения. С помощью многоканальной микропипетки дозируйте по 200 микролитров раствора фиксации во все лунки и инкубируйте в течение 10 минут.
После промывки клеток перелейте во все лунки 200 микролитров проницаемого раствора и выдержите 15 минут. Далее аспирируйте проницаемый раствор перед добавлением 100 микролитров окрашивающего раствора во все лунки. Выдерживать 30 минут при комнатной температуре.
После инкубации трижды промойте клетки 200 микролитрами промывочного раствора соединения. Чтобы просеять пластину с помощью системы визуализации с высоким содержанием микротитрования, выберите тип пластины как пластина с микротитрованием 96. Объектив как 20X с числовой апертурой 0,4 и режимом конфокала.
После этого выберите DAPI, CellMask deep red и канал mCherry, чтобы захватить окрашенные ядра, цитоплазму и сигнал бактерий соответственно. Выберите скважины пластины и соответствующие поля каждой скважины для анализа. Далее нажмите на тест и сделайте снимок, чтобы проверить настройки.
Наконец, настройте робота для работы с оборудованием, чтобы автоматизировать получение изображений в одночасье. Эта роботизированная рука заменяет пластины в системе визуализации с высоким содержанием без вмешательства человека. Соединения даунорубицин, доксорубицин, тиострептон, эпирубицин и пирвиниум памоат были токсичны для инфицированных микобактериями макрофагов, что приводило к менее чем 85% жизнеспособности клеток.
Соединения моксалактам и безифлоксацин имели менее 50% жизнеспособности микобактерий при 13,3 микромолярах, но не показали существенной разницы по сравнению с контролем ДМСО. Соединения цефдинир, гатифлоксацин и моксифлоксацин были мощными против внутриклеточных микобактерий при концентрации 13,3 мкмоль, при этом соединение пирвиния памоат было наиболее активным. Соединения, рокситромицин, кларитромицин и рифабутин, показали чрезвычайную активность против внутриклеточных микобактерий, при этом кларитромицин снижал жизнеспособность микобактерий до менее чем 10% во всех концентрациях.
