Этот проект был профинансирован Case Western Reserve University запуска средства, предоставленные Е. Веселый. Зараженные улитки были предоставлены шистосом ресурсный центр, NIH-NIAID (NIAID контракт № HHSN272201000009I). Мы также благодарим Крис Кинг и Рональд Блэнтон за поддержку в обеспечении инфицированных шистосом улиток и за полезные обсуждения.

Меры предосторожности: Шистосом церкарии могут непосредственно проникать в кожу без потребности вырезать или поры, и вызывают хронические заболевания шистосомоз. С. mansoni является уровень биобезопасности 2 организма, поэтому специальные средства защиты и надлежащие меры безопасности необходимо соблюдать при работе с инфекционным церкарии. Большая часть оборудования, необходимого для роста и преобразования шистосом является стандартным, за некоторыми исключениями ключевых отмечено в таблице в конце протокола. Все церкарий работа должна проводиться в изолированном помещении. Schistosomules должна культивироваться в стерильной, утвержденной капот биобезопасности. Два слоя латекса или нитрила перчатки, как и должно халате, водонепроницаемый туфли, брюки без каких-либо отверстий или слезы, и водонепроницаемой защиты рукав для запястья и руки. В случае аварийного разлива, немедленно распыления загрязненной территории с 70% этанола или 10% гипохлоритом натрия, потирая энергично, если на вашем лице. Этого будет достаточно, чтобы отключить паразита, но и все возможные инфекции, следует сообщать и принимать всерьез. Хотя schistosomules не врожденно инфекционный, институциональные руководящие принципы меняются, и следует обратиться, чтобы определить BSL2 меры предосторожности необходимы при неинфекционной этапах жизни. Лечить все поверхности, которые вступают в контакт с любой потенциально инфекционного вещества, после эксперимент проводится и выбросить отходы в контейнер для биологически опасных утвержденным. ПРИМЕЧАНИЕ: Обложка улитки хост бункеров от 1 до 2 дней до пролития и защищенном от света месте 1. Сбор церкарий из улитки хост <ol><li> Заполните чистый, 500 мл стакан без моющих средств на полпути полный дистиллированной водой доведены до комнатной температуры. При работе с принимающими улитки инфицированных мирацидии в разные сроки, использовать отдельный стакан для каждой инфекции дату (Это особенно важно, если улитки будут повторно использованы для будущих экспериментов). Размер стакан может быть меньше в зависимости от опыта пользователя. </li><li> Сбор зараженных хостов улитки вы хотите, чтобы пролить и тщательно сдать их в стакан с использованием стандартного аквариумных рыб сетью и общим щипцы цели по мере необходимости. </li><li> Место стакан на аварийный разлив лоток примерно от 8 до 12 дюймов под лампы накаливания источником света. Дайте отстояться в течение 1-2 часов при свете. Церкарии выхода улитки хост при воздействии яркого света. </li><li> Тщательно отфильтровать улитки из церкарии смеси. Принять дополнительные меры предосторожности, так как смесь высоко инфекционной болезнью. Помните, церкарии могут проникать непосредственно человеческой кожи! </li><li> Замените смеси под источник света в течение приблизительно 15 минут, что позволяет любому твердых частиц отходов, чтобы обосноваться. </li><li> Передача церкарии в чистую колбу использованием пипетки, избегая мусора на дне стакана. Место колбу примерно под углом 45 ° на льду в темноте в течение 45 - 60 минут, что позволяет церкарии, чтобы обосноваться в одном углу. </li><li> Используйте 50 мл пипетки, чтобы удалить от 75 до 90% от супернатант и поместить его в стакан, содержащий 10% гипохлоритом натрия или 70% этанола, заботясь, чтобы вода не капли, содержащие церкарии капать из пипетки. </li><li> Swirl колбу содержащие церкарии аккуратно ресуспендируют церкарии в растворе. Используйте пипетку для передачи образца стерильной 50 мл конические пробирки. Место трубы снова на льду в течение 20 минут в темноте. Церкарии будет располагаться в нижней части трубки в темное время суток. </li></ol> 2. Руководство преобразования церкарии к schistosomules Прежде чем вы начнете: Сделайте RPMI 1640 полная (RPMI, 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 1X Pen / Strep) и теплой до 37 ° C. (Очень важно, чтобы эмбриональной телячьей сыворотки использовали выведен путем инкубации 56 ° С в течение 1 часа, как шистосом могут быть чувствительны к дополнение). <ol><li> В биологической капот, удалить супернатант до 5 до 10 мл раствора в каждой 50 мл коническую помощью пипетки или вакуумного устройства. </li><li> Прикрепить 22 калибра двойного состава, Луер лок эмульгирующей иглу соответствующего размера шприца. </li><li> Медленно сделать смесь в шприц. Сбор церкарии из всех 50 мл пробирки в шприц. Будьте внимательны капающей. </li><li> Осторожно поверните шприц над такими, что одинокие конце иглы вверх. Прикрепить еще один шприц на эту сторону эмульгирующей иглы. </li><li> Пропустите смесь через иглу в общей сложности 40 раз (20 раз туда и обратно) для преобразования церкарий. </li><li> Позиция шприцы вертикально так, чтобы смесь содержится в нижней шприц и верхней шприц пустой. Снимите верхнюю шприц и дезинфицировать в 70% этанола. </li><li> Депозит смеси по капле в чистую высокой стеной 100 мм х 50 мм блюдо пирекса или кристаллизатор. Лечить обмена игл и шприцев в 70% этанола. </li><li> Добавить 37 ° C RPMI 1640 полная СМИ, таких, чтонижней части чашки Петри полностью покрыта, словно проливной пластины Лурия бульон. </li><li> Swirl аккуратно собирать schistosomules в центре чашки Петри. Избегайте попадания воды. Примечание: Это может быть полезно, чтобы выключить свет капот для этого шага, чтобы более адекватно визуализировать schistosomules в центре. </li><li> Сразу же депозит сосредоточены schistosomules в свежем 12-клеточной культуре также пластины хорошо использование стерильных капельницы. </li><li> Повторите 2.9 и 2.10 до schistosomules больше не присутствует в центр блюда (примерно в 10 раз). Депозит каждого последующего сбора в свежем хорошо. </li><li> Заполните каждую лунку на полпути (~ 1,5 мл) с нагретого RPMI полной информации. </li><li> Визуализация на инвертированный микроскоп для проверки наличия schistosomules и отсутствие церкарий. </li><li> Расти schistosomules в CO 2 инкубаторе набор до 37 ° С и 5% СО 2. </li></ol> 3. Представитель Результаты: До передачи преобразованных schistosomules в культуру средств массовой информации, визуализации под перевернутой светлого поля микроскопа (см. таблицу оборудования для примера) должны давать изображение, похожее на рисунок 1, в которой только трансформируется schistosomules присутствуют в скважине. Потенциальные загрязнители могут включать в себя нетронутым церкарии, разорвала церкарий хвосты, или другой мусор. Если не инвертированного микроскопа доступно, стандартный микроскоп или даже рассечение объем будет достаточным для визуализации schistosomules. Заметим, что эта процедура не всегда трансформировать 100% церкарий. <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig1.jpg" alt="Рисунок 1"/> Рисунок 1: Преобразованный шистосомулы <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig2.jpg" alt="Рисунок 2"/> Рисунок 2: Церкарии и Severed Хвосты

<ol>
	<li>Ross, A. G., Bartley, P. B., Sleigh, A. C., Olds, G. R., Li, Y., Williams, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis.">Schistosomiasis.</a> N Engl J Med. 346, 1212-1220 (2002).</li><li>Steinmann, P., Keiser, J., Bos, R., Tanner, M., Utzinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis+and+water+resources+development:+systematic+review,+meta-analysis,+and+estimates+of+people+at+risk.">Schistosomiasis and water resources development: systematic review, meta-analysis, and estimates of people at risk.</a> Lancet Infect Dis. 6, 411-425 (2006).</li><li>Savioli, L., Albonico, M., Engels, D., Montresor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+the+prevention+and+control+of+schistosomiasis+and+soil-transmitted+helminthiasis.">Progress in the prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis.</a> Parasitol Int. 53, 103-113 (2004).</li><li>King, C. H., Dickman, K., Tisch, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessment+of+the+cost+of+chronic+helmintic+infection:+a+meta-analysis+of+disability-related+outcomes+in+endemic+schistosomiasis.">Reassessment of the cost of chronic helmintic infection: a meta-analysis of disability-related outcomes in endemic schistosomiasis.</a> Lancet. 365, 1561-159 (2005).</li><li>Haas, W., Grabe, K., Geis, C., Pach, T., Stoll, K., Fuchs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+invasion+of+human+skin+by+Schistosoma+mansoni+cercariae:+the+key-role+of+L-arginine.+Parasitology.">Recognition and invasion of human skin by Schistosoma mansoni cercariae: the key-role of L-arginine. Parasitology.</a> 124, 153-167 (2002).</li><li>Grabe, K., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigation+within+host+tissues:+cercariae+orientate+towards+dark+after+penetration.">Navigation within host tissues: cercariae orientate towards dark after penetration.</a> Parasitol Res. 93, 111-113 (2004).</li><li>Shiff, C. J., Cmelik, S. H., Ley, H. E., Kriel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+human+skin+lipids+on+the+cercarial+penetration+responses+of+Schistosoma+haematobium+and+Schistosoma+mansoni.">The influence of human skin lipids on the cercarial penetration responses of Schistosoma haematobium and Schistosoma mansoni.</a> J Parasitol. 58, 476-480 (1972).</li><li>Saladin, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+cercarial+responses+to+irradiance+changes.">Schistosoma mansoni: cercarial responses to irradiance changes.</a> J Parasitol. 68, 120-124 (1982).</li><li>Chai, M., McManus, D. P., McInnes, R., Moertel, L., Tran, M., Loukas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+lung+schistosomula,+in+vitro+cultured+schistosomula+and+adult+Schistosoma+japonicum.">Transcriptome profiling of lung schistosomula, in vitro cultured schistosomula and adult Schistosoma japonicum.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 919-929 (2006).</li><li>Gobert, G. N., Tran, M. H., Moertel, L., Mulvenna, J., Jones, M. K., McManus, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+changes+in+Schistosoma+mansoni+during+early+schistosomula+development+and+in+the+presence+of+erythrocytes.">Transcriptional changes in Schistosoma mansoni during early schistosomula development and in the presence of erythrocytes.</a> PLoS Negl Trop Dis. 4, (2011).</li><li>Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+Schistosoma+mansoni+in+vitro.+I.+Establishment+of+cultures+from+cercariae+and+development+until+pairing.">Cultivation of Schistosoma mansoni in vitro. I. Establishment of cultures from cercariae and development until pairing.</a> J Parasitol. 67, 179-185 (1981).</li><li>Yoshino, T. P. &. a. m. p. ;. a. m. p., Laursen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts+from+mother+sporocysts+maintained+in+synxenic+culture+with+Biomphalaria+glabrata+embryonic+(Bge)+cells.">Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells.</a> J Parasitol. 81, 714-722 (1995).</li><li>Colley, D. G., Wikel, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+simplified+method+for+the+production+of+schistosomules.">Schistosoma mansoni: simplified method for the production of schistosomules.</a> Exp Parasitol. 35, 44-51 (1974).</li><li>Lazdins, J. K., Stein, M. J., David, J. R., Sher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+rapid+isolation+and+purification+of+schistosomula+of+different+developmental+stages+by+centrifugation+on+discontinuous+density+gradients+of+Percoll.">Schistosoma mansoni: rapid isolation and purification of schistosomula of different developmental stages by centrifugation on discontinuous density gradients of Percoll.</a> Exp Parasitol. 53, 39-44 (1982).</li><li>Cousin, C. E., Stirewalt, M. A., Dorsey, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+ultrastructure+of+early+transformation+of+skin-+and+shear-pressure-derived+schistosomules.">Schistosoma mansoni: ultrastructure of early transformation of skin- and shear-pressure-derived schistosomules.</a> Exp Parasitol. 51, 341-365 (1981).</li><li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis.">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 19, 1-1 (2001).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Некоторые потенциальные проблемы могут возникнуть во время преобразования процедура, однако этот протокол разработан, чтобы избежать большинства этих проблем. Одним из потенциальных опасностей является засорение эмульгирующей иглы, которая обычно возникает из-за мусора, оставшиеся от уборки в шаге 1.3. Будьте уверены, чтобы все твердые частицы, чтобы обосноваться в шаге 1.5 и перенести церкарии тщательно в шаге от 1,6 до избежать этой проблемы. Кроме того, как было описано выше, работающих внутри кабинета биологической безопасности, использования средств индивидуальной защиты (даже щиты лицо) и чрезмерного давления на шприцы является целесообразным. Частный церкарий хвосты могут быть визуализированы в средствах массовой информации, что свидетельствует о плохой разделения на шаге 2.9. Хвосты выставку спазм-подобные движения и имеют различные формы (см. рисунок 2), и константы выглядит так легко отличить от schistosomules. Хвосты могут быть удалены промывкой schistosomules более полной RPMI позволяет schistosomules, чтобы обосноваться. Хвосты будут оставаться на плаву и может быть пылесосом прочь. Если нетронутыми церкарии присутствуют в средствах массовой информации, преобразования в шаге 2,5 не был исполнен надлежащим образом. Образ нетронутой церкарии изображен на рисунке 3b для справки. Если эта проблема возникает, убедиться, что игла эмульгирующей используется имеет подходящий размер. Кроме того, несколько раз церкарий смесь пропускают через иглу может быть увеличена, хотя и в 40 раз, как правило, гораздо больше, чем достаточно, чтобы приближаться к 100% стрижка церкарий хвосты. Преобразование церкарии в schistosomules была впервые описана в 1974 году Колли и Wikel (13). С тех пор, подготовка schistosomules было сделано либо с помощью стрижки стратегии с помощью иглы и шприца, как описано в данном протоколе, или с использованием вортексе подход и разделенных градиенты Перколла (14, 15) или вращая, как показано в данной работе. Эти две технологии для подготовки schistosomules прекрасно описывается Фред Льюис (16) и дополнительной информации для дальнейшего культивирования schistosomules для долгосрочного роста можно найти на NIAID шистосом ресурсный центр ( <a href="http://www.schisto-resource.org/">www.schisto-resource.org</a> ).

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th></tr><tr><td> 22 г х 2-7/8 &quot;Эмульгирующий иглы </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-825-17G </td></tr><tr><td> RPMI 1640 Средний 1X (500 мл) </td><td> Invitrogen </td><td> 11835030 </td></tr><tr><td> Эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) тепловой инактивированной </td><td> Invitrogen </td><td> 10082139 </td></tr><tr><td> Пенициллин / стрептомицин (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td></tr><tr><td> Кристаллизатор (100 мм) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-741D </td></tr><tr><td> Генеральный Пинцет Цель </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-316C </td></tr><tr><td> Petco аквариум сети для артемии </td><td> Petco </td><td> Артикул: 1190954 </td></tr></tbody></table>

cercarial transformation and in vitro cultivation of schistosoma mansoni schistosomules

Шистосом паразиты являются возбудителями шистосомоз, хронически изнурительной болезни, которая затрагивает более 200 миллионов человек во всем мире и занимает второе место с малярией среди паразитарных болезней с точки зрения общественного здравоохранения и социально-экономические последствия (1-4). Шистосом паразиты трематод червей со сложным жизненным циклом перестановки между паразитический образ жизни в моллюсков и млекопитающих хостов с промежуточной свободное плавание этапов. Одним словом, свободно плавающие церкарии заразить млекопитающего путем облучения кожи с помощью выделяемых протеаз, в течение которых церкарии теряют свои хвосты, превращаясь в schistosomules. Schistosomules теперь должны уклоняться от иммунной системы, разрабатывает кишечнике для переваривания красных кровяных клеток, и мигрируют хотя легких и портальной циркуляции в пути к месту назначения в портальной системе печени и в конечном итоге брыжеечной вены (для S. mansoni) где мужские и женские пары червей и мат, производя сотни яиц в день. Некоторые из яиц выводятся из организма в пресную воду, где из яиц вылупляются в свободное плавание мирацидиев (5-10). Мирацидии инвазии конкретных видов улиток и превратить в мать и дочь спороцист, который, в свою очередь, вырабатывают инфекционных церкарии, завершение жизненного цикла. К сожалению, весь жизненный цикл шистосом не может быть культивировали в пробирке, но инфекционный церкарии могут быть преобразованы в schistosomules и schistosomules может быть культивировали в течение недели для анализа шистосом развития в пробирке или микрочипов анализа. В этом протоколе, мы предоставляем визуальное описание церкарий преобразования и в лабораторных условиях культивирования schistosomules. Мы пролили инфекционных церкарий из Biomphalaria glabrata хост улитки и вручную преобразовать их в schistosomules путем отделения хвосты использованием эмульгирующих двусторонняя игла. В пробирке церкарий трансформации и методы schistosomules культуры описано избежать использования млекопитающего, который упрощает визуализацию шистосом и облегчает сбор паразита для экспериментального анализа. Преобразования в пробирке и культивирование техники шистосом было сделать в течение многих лет (11, 12), но никаких визуальных протоколы были разработаны, которые доступны для всего сообщества.

Watch this Scientific Journal Video about Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules at JoVE.com

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Мы описываем<em&gt; В пробирке</em&gt; Метод культивирования шистосомул из плоских червей паразитов<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt;, С помощью сбора и преобразования инфекционного церкарий из пресной воды улитки промежуточных glabrata хост Biomphalaria.

Трансформация и церкарий В пробирке Выращивание Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

cercarial-transformation-vitro-cultivation-schistosoma-mansoni

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

17.9K Views.  Case Western Reserve University. Мы описываем В пробирке Метод культивирования шистосомул из плоских червей паразитов Schistosoma mansoni, С помощью сбора и преобразования инфекционного церкарий из пресной воды улитки промежуточных glabrata хост Biomphalaria.

Video: Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

В пробирке раздевания ВИЧ-1 сердечников

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe pathology, including liver fibrosis and splenomegaly, is caused by the immune response to the parasite eggs rather than the parasite itself 2. Parasite eggs induce a Th2 response characterized by the production of IL-4, IL-5 and IL-13, the alternative activation of macrophages and the recruitment of eosinophils. Here, we describe injection of Schistosoma mansoni eggs as a model to examine parasite-specific Th2 cytokine responses in the lung and draining lymph nodes, the formation of pulmonary granulomas surrounding the egg, and airway inflammation. 
Following intraperitoneal sensitization and intravenous challenge, S. mansoni eggs are transported to the lung via the pulmonary arteries where they are trapped within the lung parenchyma by granulomas composed of lymphocytes, eosinophils and alternatively activated macrophages 3-6. Associated with granuloma formation, inflammation in the broncho-alveolar spaces, expansion of the draining lymph nodes and CD4 T cell activation can be observed. Here we detail the protocol for isolating Schistosoma mansoni eggs from infected livers (modified from 7), sensitizing and challenging mice, and recovering the organs (broncho-alveolar lavage (BAL), lung and draining lymph nodes) for analysis. We also include representative histologic and immunologic data and suggestions for additional immunologic analysis. 
Overall, this method provides an in vivo model to investigate helminth-induced immunologic responses in the lung, which is broadly applicable to the study of Th2 inflammatory diseases including helminth infection, fibrotic diseases, allergic inflammation and asthma. Advantages of this model for the study of type 2 inflammation in the lung include the reproducibility of a potent Th2 inflammatory response in the lung and draining lymph nodes, the ease of assessment of inflammation by histologic examination of the granulomas surrounding the egg, and the potential for long-term storage of the parasite eggs.

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma mansoni eggs are potent stimulators of the T helper type 2 (Th2) immune response, characteristic of parasite infection, asthma and allergic inflammation. This protocol utilizes S. mansoni egg injection to generate a CD4 Th2 cytokine-induced inflammatory response in the lung, characterized by lung granuloma formation around the egg, eosinophilia and macrophage alternative activation.

Использование Яйца<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; А<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Модель гельминтов вызванных воспалением легких

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Количественный<em&gt; В пробирке</em&gt; Анализе на определение адгезию нейтрофилов к активированным Первичные человеческие эндотелиальные клетки микрососудов в статических условиях

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that employs multiple immunomodulatory mechanisms to establish chronic infection in mice and closely resembles prevalent human helminth infections. H. polygyrus has been studied extensively in the field of helminth-derived immune regulation and has been found to potently suppress experimental models of allergy and autoimmunity (both with active infection and isolated secreted products). The protocol described in this paper outlines management of the H. polygyrus life cycle for consistent production of L3 larvae, recovery of adult parasites, and collection of their excretory-secretory products (HES).

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus is a murine nematode with powerful immunomodulatory capabilities that closely resemble those of highly-prevalent human helminth infection. Here we describe a protocol for the long-term maintenance of the H. polygyrus lifecycle.

Выращивание<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; Иммуномодулирующая нематода Паразит и его секретируемые продукты

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

Баллистической трансформации флуоресцентного Tagged гена в оппортунистических грибковых возбудителя<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Presented here is a unified description of techniques that can be used to develop, transform, administer, and test heterologous protein expression of the probiotic yeast Saccharomyces boulardii.

Трансформация пробиотических дрожжей и их восстановление из желудочно-иммунных тканей После желудочный зонд у мышей

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by pharmaceutical companies is a market opportunity, but it is also a strategy to increase drug accessibility and reduce therapy-associated costs. The protocols detailed here describe the evaluation of target binding and CDC induction by rituximab in Daudi cells. These two functions require different structural regions of the antibody and are relevant to the clinical effect induced by rituximab. The protocols allow the side-to-side comparison of a reference rituximab and a marketed rituximab biosimilar. The evaluated products showed differences both in target binding and CDC induction, suggesting that there are underlying physicochemical differences and highlighting the need to analyze the impact of those differences in the clinical setting. The methods reported here constitute simple and inexpensive in vitro models for the evaluation of the activity of rituximab biosimilars. Thus, they can be useful during biosimilar development, as well as for quality control in biosimilar production. Furthermore, the presented methods can be extrapolated to other therapeutic mAbs.

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

This protocol describes the in vitro comparison of two key functional characteristics of rituximab: target binding and complement-dependent cytotoxicity (CDC) induction. The methods were employed for a side-to-side comparison between reference rituximab and a rituximab biosimilar. These assays can be employed during biosimilar development or as a quality control in their production.

В методах Vitro для сравнения цели связывания и CDC Индукционные Между терапевтических антител применения в анализе Biosimilarity

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of heterogeneous vesicles, whose size range between 40 and 1,000 nm. Accumulated evidence indicated that EVs play important regulatory roles in pathogen-host interactions. A deep understanding of schistosome EVs should provide insights into the mechanisms underlying schistosome-host interactions, enabling development of novel strategies against schistosomiasis. Here, we aim to further study EVs functions in schistosomes by presenting a protocol for the isolation and characterization of EVs from adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs were isolated from in vitro culture medium using centrifugation combined with a commercial exosome isolation kit. The isolated S. japonicum EVs (SjEVs) typically possess a diameter of 100 - 400 nm, and are characterized by transmission electronic microscopy and western blotting. The usage of PKH67 dye-labeled SjEVs has demonstrated that SjEVs are internalized by the recipient cells. Overall, our protocol provides an alternative method for isolating EVs from adult schistosomes; the isolated SjEVs may be suitable for functional analysis.

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Here, we present a protocol to describe extracellular vesicles (EVs) isolation in in vitro cultured medium from adult Schistosoma japonicum.

Изоляция и характеристика внеклеточного везикулы от взрослых Schistosoma японский

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, investigations of interactions between endobiotics (e.g., drugs and prebiotics) and gut microbiota have become an important research topic. However, in vivo experiments with human volunteers are not ideal for such studies due to bioethics and economic constraints. As a result, animal models have been used to evaluate these interactions in vivo. Nevertheless, animal model studies are still limited by bioethics considerations, in addition to differing compositions and diversities of microbiota in animals vs. humans. An alternative research strategy is the use of batch fermentation experiments that allow evaluation of the interactions between endobiotics and gut microbiota in vitro. To evaluate this strategy, bifidobacterial (Bif) exopolysaccharides (EPS) were used as a representative xenobiotic. Then, the interactions between Bif EPS and human gut microbiota were investigated using several methods such as thin-layer chromatography (TLC), bacterial community compositional analysis with 16S rRNA gene high-throughput sequencing, and gas chromatography of short-chain fatty acids (SCFAs). Presented here is a protocol to investigate the interactions between endobiotics and human gut microbiota using in vitro batch fermentation systems. Importantly, this protocol can also be modified to investigate general interactions between other endobiotics and gut microbiota.

Described here is a protocol to investigate the interactions between endobiotics and human gut microbiota using in vitro batch fermentation systems.

Анализ взаимодействия между эндобиотики и человека кишки микробиоты использованием в пробирке ванны системы брожения

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

Высокоэффективная трансфекция первичных макрофагов с помощью In Vitro транскрибированная мРНК

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...