Поддержка Национального института здоровья грант R01EY018144.

1. Производство, складывая и ВЭЖХ очистки Холо-RBP <ol><li> Преобразование BL-21cells с вектором рЕТ3а несущие кДНК человека RBP с 6-кратным теги Его на N-конце. Расти превращается BL-21 клеток в шейкере при 37 ° С в 40 мл LB среды с карбенициллин до OD при 600 нм достигает 0,5. Вызвать RBP экспрессии белка путем добавления IPTG до 1 мм. Рост бактерий при 37 ° C еще 5 часов. </li><li> RBP производится в E.coli в основном присутствует в нерастворимые телец включения. Для обогащения телец включения, осадок клеток при 10000 х г в течение 20 мин. Тогда разрушать ультразвуком клетки на льду в 5 мл PBS с ингибиторами протеазы, а затем 2 циклов замораживания и оттаивания. Пелле по тел включения при 20000 х г в течение 30 мин при 4 ° C. Удалите супернатант и сохранить осадок на льду. </li><li> Растворения включения тела гранулы с помощью ультразвука в 10 мл 7,5 М гидрохлорида гуанидина. Добавить половину объема (5 мл) в 25 мМ Трис-буфера, рН 9,0 и DTT до конечной сoncentration 10 мМ. Энергично перемешайте раствор на вихревой смеситель ночь при комнатной температуре в полной мере уменьшения и денатурации белков. </li><li> Центрифуга белковый раствор для удаления нерастворимого материала при 18000 х г в течение 20 мин при 4 ° C. После того, как спина, передает супернатант в новую пробирку и поместить пробирку на льду. </li><li> Подготовка четырех томах (60 мл) рефолдинг буфере (25 мМ Трис, рН 9,0, 0,3 мМ цистин, цистеин 3,0 мМ, 1 мМ ЭДТА). Дега рефолдинг буфера. Также приготовьте 600 мкл 10 мМ ретинола в этаноле при тусклом красном свете. Держите его в темноте на льду. Оба буфера повторной укладки и ретинола решения должны быть свежеприготовленной. </li><li> Охладить и белкового раствора и складывая буфера на льду в течение по крайней мере 30 мин. Повышение температуры всего снижает качество сложил ОДП. Добавить 1 мл рефолдинг по каплям буфера и 10 мкл ретинол решение в свою очередь, в то время как белковый раствор энергично смешать в стакане со льдом. Повторите этот шаг, пока все буфере повторной укладки и ретинолдобавлены. Продолжайте размешивать реакция на льду в темноте в течение 5 часов. </li><li> Спином вниз рефолдинг реакции при 24000 х г в течение 30 мин при 4 ° C. Важно, чтобы удалить агрегатов сразу после рефолдинг реакции. </li><li> Концентрат супернатант решения с использованием Amicon Ультра 15 концентратора (MWCO 10 K) до примерно 10 мл. Не концентрируйтесь сложил решение более такого уровня. Обогатительный слишком много приведет к агрегации белков и снижает конечный выход и качество правильно сложить ОДП. Развести концентрированный образца с холодным PBS до 100 мл. Цель этого шага заключается в удалении компонентов в рефолдинг реакции, которые мешают очистке никеля. </li><li> Побочные решение еще раз при 24000 х г в течение 20 мин при 4 ° C. Важно, чтобы удалить осадок. Передача супернатант до двух 50 мл пробирок, содержащих по 1 мл Ni-NTA суспензии, которая была промывали PBS. Поворот трубы при 4 ° С в течение одного часа. Инкубация разбавленный раствор Fили 1 часа может привести к выпадению неправильно упакованных белков, которые должны быть удалены. </li><li> Спином вниз трубы при 500 мкг в течение 3 мин. Удалить супернатант осторожно. Все плавающие должны быть удалены. Добавить холодным PBS до 30 мл для каждой трубки. Побочные снова и удалите супернатант. Повторите этот процесс, пока Вы не увидите ничего, кроме бисера в трубке. </li><li> Передача Ni-NTA смолы в пустую колонку. Вымойте смолы с 20 объемами колонки 10 мМ имидазола, 500 мМ NaCl в PBS. Его Элюировать-RBP в 5 объемов колонки 100 мМ имидазола в PBS. Не хранить это решение в течение длительного периода времени, а также замораживание снижает конечный выход и качество. Для получения лучшего результата, очищают с помощью ВЭЖХ RBP немедленно. </li><li> Его диализировать-RBP очищают от Ni-NTA смолы против 25 мМ Трис, рН 8,4, 120 мМ NaCl. Концентратор также может быть использована для буфера обмена. Ясно образцов для ВЭЖХ путем центрифугирования при 16000 х г в течение 10 мин при 4 ° C перед каждым запуском. </li><li> Очищают голо-RBP на ВЭЖХ с использованием ионнойобменной колонны AX-300 от градиента NaCl шагом (220 мм 12 мин, 360 мм, 15 мин и 1.000 мм 15 мин) с использованием 25 мМ Трис, рН 8,4 в качестве подвижной фазы на 1 мл / мин. Как NaCl повышении концентрации, голо-His-RBP выпущена в то время как апо-RBP и неправильно свернутых RBP остаются связанными с колонкой (рис. 1). Если RBP рефолдинг не сделать оптимально, неправильно свернутых RBP (например, неправильно свернутых RBP-я в рис. 1) может преобладать всей подготовки. </li><li> Восстановление правильно сложить голо-RBP от пика фракций на 360 мм NaCl. Внимательно следите профиль элюирования правильно сложить и неправильно свернутых Его-RBP. В 1000 мм NaCl, большинство из неправильно свернутых Его-RBP должны быть освобождены. </li><li> Фракции, содержащие голо-RBP объединяют, концентрируют и диализуют против PBS в течение ночи при 4 ° C. Дата окончательного урожайности и качества (330 nm/280 нм) на спектрофотометре. Правильно сложить продукт должен иметь nm/280 330 нм отношение немного выше, чем за 1 (рис. 1). </li><li> Для производстваэлектронной апо-РСБ, добавляют равный объем гептана в очищенном голо-RBP и аккуратно перемешать, вращая течение ночи при 4 ° C. Центрифуга при 16000 г в течение 10 мин при 4 ° C и тщательно передать нижней водной фазы в новую пробирку (избегая осадок на границе). Повторите процедуру три раза с 3 ч инкубации для каждого. Проверьте поглощения на спектрофотометре NanoDrop чтобы убедиться, что 330 нм пика снизилась до фонового уровня. </li></ol> 2. В режиме реального времени мониторинг STRA6 катализируемой Ретинол Ретинол выбросов и Загрузка <ol><li> Блок черный 96-а Microfluor-2 пластины (Thermo Scientific) с 200 мкл Blocker казеина (Pierce) в течение ночи при 4 ° С, чтобы предотвратить прилипание неспецифической голо-RBP к пластику. Blocker казеина дает лучший блокирующий эффект все блокировки решений мы тестировали. </li><li> Мембраны свежеприготовленный из клеток, экспрессирующих STRA6 или контроль клетки промывали PBS использования и пропускают через Гамильтон шприц (GastiGHT # 1710) 6 раз до получения однородной суспензии в PBS. Мы обычно используют мембраны, полученные от 1/100 до 1/20 клеток, выращенных на 100 мм блюдо за реакцией. </li><li> Промойте лунки из Microfluor-2 пластины один раз 200 мкл PBS. Охладить пластины на льду перед добавлением суспензии мембран (50 мкл на лунку). </li><li> Мониторинг в режиме реального времени ретинола флуоресценции измеряют с помощью флуоресценции оптики Полярная звезда Omega (BMG Labtech) с возбуждением фильтр 320EX и фильтр твердых 460-10. Программа установлена ​​в режим чтения Endpoint. Плита режим также может быть использован для измерения времени, конечно, если интервалы времени не изменяется. Сигнал от каждого момента времени является в среднем на 10 измерений (орбитальная усреднения с диаметром 2 мм), а коэффициент усиления установлен на уровне 1.800. Пластину встряхивают в течение 10 сек при 500 оборотов в минуту использовании двойных орбитальное вращение перед каждым измерением. </li><li> Чтобы начать ретинол анализа релизе, скважин читать один раз, используя Endpoint м чтенииода до голо-RBP (как правило, 1 мкМ конечной концентрации) добавляют при 0 мин. Как только голо-RBP добавляют, реакция постоянно контролируется каждые 5-10 мин в течение 1-3 часов. Чтобы начать ретинол анализа загрузки, полностью транс-ретинол (как правило, 1 мкМ конечной концентрации) добавляют в лунки при тусклом красном свете. Пластина читается один раз перед апо-RBP добавляют при 0 мин. Как только апо-RBP добавляют, реакция постоянно контролируется каждые 5-10 мин в течение 1-3 часов. </li><li> После всех измерений сделано, скачать исходные данные (например, показано на рисунке 2) из анализа Omega данных программного обеспечения (BMG Labtech) в Microsoft Excel для анализа данных. Каждый раз, когда точка создает файл, который содержит показания всех экспериментальных условиях. Например, если имеется 20 временных точках, консолидировать 20 файлов в один файл Excel для анализа данных. </li><li> Для анализа данных, сигналов флуоресценции перед добавлением ретинола или голо-RBP на 0 мин считаются фоне сигналовD вычитается из окончательной сигналов флуоресценции во всех временных точках. Несмотря на фоне сигналов низкой по сравнению с ретинолом флуоресценции в голо-RBP, вычитания фона исключает неспецифическое влияние рассеяния света мембран и дает возможность сосредоточиться на ретинол флуоресценции голо-RBP или ретинол добавляют при 0 мин. </li></ol> 3. В режиме реального времени мониторинг STRA6 катализируемой транспорта ретинола с Холо-RBP на CRBP-I <ol><li> Ретинол-EGFP является новой флуоресценции передачи резонанса (FRET) пара, которая недавно была создана 41. STRA6 катализируемой ретинол транспорта от голо-RBP на EGFP-CRBP-I контролируется в режиме реального времени путем измерения ретинол-EGFP FRET. EGFP-CRBP-я слитого белка с 6XHis тегов (EGFP-CRBP-I) образуется в клетках млекопитающих и очищают на Ni-NTA смолы перед экспериментом. EGFP-CRBP-I могут быть сохранены в PBS с ингибиторами протеазы в течение короткого периода времени при 4 ° C. Кроме гибридного белка яс замороженными в -80 ° C в небольших аликвотах. </li><li> Перед реакций, подготовить их Microfluor-2 пластины и мембраны, как описано выше. Промойте лунки из Microfluor-2 пластины один раз 200 мкл PBS перед добавлением суспензии мембран (50 мкл на лунку). </li><li> В режиме реального времени ретинол-EGFP FRET измеряется с помощью Полярная звезда Omega с возбуждением фильтр 320EX и выбросов фильтрами 460-10 и 510-10, используя одновременно дуэль излучения флуоресценции оптики. Программа установлена ​​в режим чтения Endpoint. Плита режим также может быть использован для измерения времени, конечно, если интервалы времени не изменяется. Сигнал от каждого момента времени является в среднем на 10 измерений (орбитальная усреднения с диаметром 2 мм) и усиление установлено на высоте 1800 на канал. Пластину встряхивают в течение 10 сек при 500 оборотов в минуту использовании двойных орбитальное вращение перед каждым измерением. </li><li> Для начала реакции, EGFP-CRBP-I (как правило, 1 мкМ конечной концентрации) добавляют в лунки. Пластина читать дальшесе, используя режим Endpoint чтении до голо-RBP добавляют при 0 мин. Как только голо-RBP добавляют, реакция постоянно контролируется путем измерения каждые 5-10 мин в течение 1-2 часов. </li><li> После всех измерений сделано, скачать исходные данные (например, показано на рисунке 3) из программного обеспечения для анализа Omega данных в Microsoft Excel для анализа данных, как описано выше. </li><li> Ретинол-EGFP FRET рассчитывается путем динамического изменения в соотношении акцептором / донора выбросов пики 47. Уравнение 41 до рассчитать это соотношение [(510 т -510 б) / (460 т -460 б)], где 510 т, 510 б, 460 т и 460 б представляют выбросы на 510 нм после начала реакции ( T = время точки), при 510 нм до ретинола или голо-RBP добавлена ​​(б = фоне), при 460 нм после начала реакции (Т = момент времени), а при 460 нм до ретинола или голо-RBP добавлен (б = фоне), соответственно. </li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Мы разделяем здесь оптимизированный протокол производство ОДП, потому что RBP производства и очистки имеют решающее значение для создания правильно сложить ОДП. Учитывая возможность неправильно свернутых видов ОДП и наличие следовых количеств бактериальных белков даже в ВЭЖХ очищенн...

Витамин А является органической молекулой, которая необходима для выживания человека и надлежащее функционирование практически всех органов человека. Производные витамина А (ретиноиды) участвовать в разнообразных биохимических и клеточных событий, в том числе датчиков света за 1,2 видение и регуляции экспрессии генов и белков перевода во время эмбрионального развития и в тканях взрослого 3-6. Несмотря на то, ретинол обладает способностью диффундировать системно, эволюция придумала плазмы ретинол связывающий белок, специфический белок-носитель витамина транспорта в крови для достижения высокой эффективности и специфичности и, чтобы избежать токсичности, связанной со случайным диффузии 7-10. Высокое сродство рецептора, который связывается с ОДП и занимает витамин Была выдвинута гипотеза, в 1970-х годах 11-13. Несмотря на фактических данных, накопленных в течение трех десятилетий о существовании рецепторов RBP 14-31, рецептор гипотеза обсуждалась в течение многих лет из-за existencе неправильное определение голо-РСБ. Правильное определение голо-РСБ является то, что высокое сродство комплекса 1:1 между ретинолом и ОДП. Повторное извлечение голо-RBP органических растворителей необходимо производить апо-РСБ. Это определение используется почти во всех лабораториях изучения RBP 7,9,32-35 или рецептора RBP 14-31,36-42. Неверное определение голо-РСБ, который был использован, чтобы опровергнуть существование рецепторов КПБ является острая смесь свободного ретинола с апо-РСБ. Поскольку функция RBP рецептора витамина поглощения от голо-РСБ является освобождение ретинола от голо-РСБ, рецептор RBP будет играть никакой роли в ретинол поглощения, если ретинол является бесплатным для начала (как это было предложено неправильное определение голо -RBP). Последнее определение RBP рецептора белка домена multitransmembrane называется STRA636 и его функции витамина поглощения от голо-RBP 36-43 решительно выступает против гипотезы, что RBP ненужно рецепторов для доставки витамина А. Подробный анализ показал, что STRA6 имеет 9 трансмембранных доменов с N-конца расположены внеклеточно и С-концом расположена внутриклеточно 40. Расположенный между трансмембранными 6 и 7 является одним из важнейших RBP связывающий домен 39. STRA6 соединен с обеих LRAT и CRBP-I в витамин А поглощение от голо-РСБ, но ни LRAT ни CRBP-я абсолютно необходима для повышения STRA6 деятельности 41. Способность STRA6 по активизации ретинол освобождение от голо-РСБ является ключом к ее поглощению витаминов деятельности 41. Опираясь на STRA6 выпустить свой ретинол, витамины доставки RBP может транспортировать витамин А к клеткам-мишеням в периферических тканях с высокой специфичностью и эффективностью. Решающее значение голо-RBP определению и подготовке иллюстрируется не только исторические дебаты о существовании рецепторов КПБ, но и трех связанных с недавних работ на основе голо-RBP определения различотличный от оригинала и правильное определение 44-46. В первом документе использованы голо-RBP определение, которое было использовано для одобряют существование RBP рецепторов для изучения рецепторов RBP 44. Вторая и третья работы придумали третье определение голо-РСБ, что сделало его еще менее вероятно, для ретинола должны быть изучены, чтобы сформировать правильный комплекс с ОДП 45,46. Эти исследования подготовлены 3 H-retinol/RBP путем смешивания голо-RBP (даже не апо-РСБ) с 3 H-ретинол. С этого анализа не есть 3 H-retinol/RBP сформирован и не снять излишнее бесплатно 3 H-ретинол 45,46, это не тест для 3 H-ретинол поглощения от 3 ​​H-retinol/RBP, но это бесплатный 3 H-ретинол диффузии анализа. Было показано ранее, что STRA6 не увеличивает поглощение клетками свободного ретинола по LRAT 38 или CRBP-I 41. Практически все ретинола связана с ОДП в крови, и нет обнаруживаемых частотыэлектронной ретинола. Основной функцией рецептора RBP является ускорение ретинол освобождение от голо-РСБ во время ретинол поглощения от голо-RBP 41. Если ретинол искусственно выпустили или в свободной форме, чтобы начать с 45,46, рецептор RBP не нужен. Резко отличается от результатов, полученных свободной анализа диффузии ретинола по сравнению с анализы, основанные на правильно подготовленную голо-RBP показывают, что правильная подготовка RBP имеет решающее значение для его функционального анализа. RBP может быть очищен из сыворотки крови человека 41, но процедура является сложной и низкая урожайность. Альтернативным подходом является создание RBP в E. палочки. Потому E. палочки не имеют возможности правильно сложить млекопитающих секретируемых белков с более чем одной парой дисульфидных связей, как RBP, важно, чтобы сложите RBP и очистить правильно сложить белка. Неправильно упакованных белков не только ведут себя иначе, исправлены сложенном RBP в различные анализы,но и привести к агрегации белков при хранении. По той же причине, апо-RBP производится только из высококачественных голо-РСБ. Мы описываем здесь оптимизированный протокол для получения высокого качества RBP загружены на 100% с ретинолом через бактериальные выражения, рефолдинг, и ВЭЖХ очистки. ВЭЖХ очистки не только удаляет неправильно сложил ОДП, но и значительное бактериальное загрязнение, которое может вызвать серьезные артефакты, если RBP используются в анализах сигнала. Мы также описывают два чувствительных мониторинга в реальном времени методы для изучения ретинол транспорта STRA6. Оба метода зависит от высокого качества RBP. Из-за ограниченности пространства, классические методы радиоактивного ретиноидов основе и ВЭЖХ на основе витамина А поглощение анализы не были описаны здесь.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название Реагенты / Материал </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> гуанидингидрохлорида </td><td> EMD </td><td> 5010 </td><td></td></tr><tr><td> цистин </td><td> Сигма </td><td> C8755 </td><td></td></tr><tr><td> цистеин </td><td> Сигма </td><td> C7352 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Рыбак </td><td> BP118-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tris </td><td> Рыбак </td><td> 7786-1 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> EMD </td><td> 3860 </td><td></td></tr><tr><td> ретинол </td><td> Сигма </td><td> R7632 </td><td></td></tr><tr><td> карбенициллин </td><td> Рыбак </td><td> BP2648-5 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> EMD </td><td> 5810 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> EMD </td><td> 6508 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Рыбак </td><td> BP358-10 </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA </td><td> Qiagen </td><td> 1018244 </td><td></td></tr><tr><td> имидазол </td><td> EMD </td><td> 5720 </td><td></td></tr><tr><td> гептан </td><td> EMD </td><td> HX0295-1 </td><td></td></tr><tr><td> Blocker казеина </td><td> Проколоть </td><td> 37528 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ультра 15 концентратора (MWCO10 K) </td><td> Millipore </td><td> UFC901024 </td><td></td></tr><tr><td> Microfluor-2 пластины </td><td> Рыбак </td><td> 14-245-177 </td><td></td></tr><tr><td> Гамильтон шприц Газонепроницаемый # 1710 </td><td> Рыбак </td><td> 14-824-655 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein

Витамин А необходим для зрения и роста / дифференциации практически всех органов человека. Плазменные ретинол-связывающего белка (РСБ) является принципом и конкретным носителем витамина А в крови. Здесь мы опишем технику оптимизированный для производства и очистки голо-RBP и два в реальном времени методы мониторинга для изучения транспорта витамина А на высокое сродство рецептора RBP STRA6. Первый метод позволяет производить большое количество высококачественного голо-RBP (100% загружены с ретинолом) витамина транспорта анализов. Высокое качество RBP имеет важное значение для функционального анализа, потому что неправильно свернутых RBP-релизы витамин А легко и бактериального загрязнения в подготовке RBP может привести к появлению артефактов. Мониторинг в реальном времени методы, как электрофизиологии внесли решающий вклад в исследования мембранного транспорта. RBP рецептор-опосредованного транспорта ретинола не были проанализированы в реальном времени до недавнего времени. Второй метод, описанный здесь, является причинамл-временной анализ STRA6 катализируемой ретинол освобождение или нагрузки. Третий способ в режиме реального времени анализ STRA6 катализируемой ретинол транспорта от голо-RBP к сотовым ретинол связывающий белок I (CRBP-I). Эти технологии обеспечивают высокую чувствительность и разрешение при выявлении витамина RBP рецептора механизм усвоения.

Мы приведем здесь представитель результатов голо-RBP производства и очистки с помощью ВЭЖХ (рис. 1), в режиме реального времени анализ STRA6 катализируемой ретинол освобождение от голо-RBP и ретинола загрузки в апо-ОДП (рис. 2) и в режиме реального времени анализ STRA6 катализир...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein at JoVE.com

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Здесь мы опишем технику оптимизированный для производства высококачественных витаминов A / RBP комплекс и два мониторинга в реальном времени методы для изучения витамина транспорта STRA6, RBP рецепторов.

В режиме реального времени Анализы транспорта ретинола на мембранный рецептор плазменных Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

real-time-analyses-retinol-transport-membrane-receptor-plasma-retinol

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K Views.  University of California, Los Angeles. Здесь мы опишем технику оптимизированный для производства высококачественных витаминов A / RBP комплекс и два мониторинга в реальном времени методы для изучения витамина транспорта STRA6, RBP рецепторов.

Video: Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Измерение плазматической мембраны Белки Endocytic Цены на Реверсивные биотинилирование

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Количественное измерение GLUT4 транслокации к плазматической мембраны с помощью проточной цитометрии

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

Биохимические Восстановление стероидных рецепторов • Hsp90 белковые комплексы и Реактивация связывания лигандов

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

Отображение молекулярной диффузии в плазме мембраны Несколько-Target трассировки (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

Мониторинг в реальном времени лиганд-рецепторных взаимодействий с флуоресцентной резонансного переноса энергии

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Очистки белков-Free метод привязки Определение Affinity по Микромасштабные Термофорез

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Изображений с плазменным Мембрана Деформации С pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

В режиме реального времени измерения мембранного белка: рецептор взаимодействий с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Зеленый флуоресцентный белок на основе Expression Скрининг мембранных белков в<em&gt; Кишечная палочка</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

Зонд на основе ПЦР в реальном времени подходов к количественному измерению микроРНК

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

В режиме реального времени Анализы транспорта ретинола на мембранный рецептор плазменных Retinol Binding Protein

PLAYLIST