This work was supported by a grant from the NIH. The assays shown in Figure 1 was performed by Dr. Joseph Fasolo. We thank Dr. Rui Chen for helpful comments.

1. Зонд Подготовка <ol><li> Культура и очистить V5-киназы фьюжн зондов, используемых для изучения взаимодействий с другими белками следующим образом: <ol><li> Используйте недавно прожилками деформации Y258 дрожжей (MATa pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112), содержащий V5-слитый белок (выраженное с GATEWAY векторных pYES-DEST52). Используйте изолированный белок в качестве зонда на микрочипов. Плита дрожжи на синтетические полная-урацил (SC-Ура) / 2% декстроза / агар и растут при температуре 30 ° С в течение 3 дней с замороженной культуры (-80 ° С глицерин фондовом). </li><li> Посев закваски (5-20 мл) от одной колонии и расти в течение ночи в Sc-Ura / 2% декстрозы при встряхивании платформы (220-250 оборотов в минуту) или колесо при 30 ° С. </li><li> На следующее утро, привить 400 мл SC-Ура / 2% рафиноза культуры с достаточной культуры стартера до конечного OD 600 0,1. </li><li> Расти посевного для OD 600 0,6 с последующим галактозы индукции V5-киназы-фуSion построить выражение с помощью добавления раствора 3x дрожжевого экстракта / пептон (YEP) с добавлением 6% галактозы, добавляя достаточно, чтобы разбавить индукции носитель с коэффициентом 3, так что конечная концентрация галактозы составляет 2%. </li><li> Индуцируют клетки при 30 ° С в течение 6 ч на качалке платформы. Используйте 2 л колбу Эрленмейера, чтобы обеспечить надлежащее проветривание. </li><li> Урожай клетки с использованием ротора JA-10 (или сопоставимый), вращая 400 мл клеточной суспензии при 1000 х г в течение 5 мин при 4 ° С. </li><li> Вымойте клетки один раз с 50 мл ледяной PBS буфер и передают в 50 мл коническую трубку. Вымойте гранул раз в ледяной буфера PBS (без моющих средств или других добавок), используемых для лизиса и передачи до 2 мл оснастки колпачок трубки для лизиса. </li><li> Спин клетки при 20000 х г в течение 1 мин при 4 ° С до гранул и пипеткой вдали буфера. </li><li> Поместите трубки на льду и заполните лизиса шагу. </li><li> Лизировать клетки (250-350 мкл гранул) с 00,5 мм оксида циркония в соотношении 1: 1: объем клеточного осадка, бисера и фосфатно-солевом буфере (PBS) буфере для лизиса 1 и вихревых смеси с использованием агитацией платформа 3 раза в 2-минутными интервалами при 4 ° С. </li><li> Центрифуга лизата при 20000 х г в настольной микроцентрифуге в течение 10 мин при 4 ° С. </li><li> Пипетка супернатант в поликарбонат высокоскоростной центрифужную пробирку и уточнить по ulracentrufugation в течение 30 мин при 150000 х г при 4 ° С. </li><li> Передача осветленной лизата в пробирку, содержащую предварительно промытую Ni 2+ аффинной смолы (~ 100 мкл) и инкубируют на nutator в течение 2 ч при 4 ° С для захвата гистидин (His) 6X помечены V5-слитый белок. </li><li> Промыть смолы три раза в течение 10 мин при 4 ° С промывочным буфером. Гранул смолы с использованием таблицы центрифуге в течение 5 мин при 1000 х г при 4 ° С и аспирата супернатант. Добавить свежий промывочный буфер при каждой стирке и вернуться трубки nutator для агитации во время стирки. </li><li> После стирки стеPS являются полными, применяют промытый смолы на свежую G-25 колонке дл элюировани. </li><li> Применить 25 мкл буфера для элюции в поэтапно, начиная с 100 мМ имидазола до 500 мМ имидазола в 50 мм для приращений в общей сложности 9 фракций. </li><li> Анализе собранных фракций использованием додецилсульфата натрия полиакриламидном геле (SDS-PAGE) и Кумасси окрашивания для идентификации наиболее высоко фракции, обогащенной (ы) для использования в анализе и добавить глицерин до 30% и хранить при температуре -80 ° С до использования в Анализ. </li></ol></li></ol> 2. Исследование массивов ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь шаг 2.6 этого раздела, чтобы подготовить раствор антител до начала анализа. <ol><li> Для обнаружения взаимодействий, разбавить V5-флуорофор конъюгированного антитела (т.е. AlexaFluor 647) 260 нг / мл в буфере зонда и тщательно перемешать, встряхивая. ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте раствор антител 30 мин до использования и поместите трубку на nutatили или колеса для обеспечения полного перемешивания и гомогенную суспензию антитела. </li><li> Развести белка зонд V5-фьюжн в диапазоне концентраций от 5-500 мкг / мл. ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизирован для каждого взаимодействия анализе белок-белок, используя буфер зонда. Оптимизация включает в себя добавление более зондов для исследования буфера. Обычно 10 мкг / мл используют в качестве отправной точки, и соответствующим образом скорректированы на основе сигнала. </li><li> Удалить белковых микрочипов из морозильника (-20 ° C) и довести до 4 ° С в холодильнике до использования. </li><li> Добавить блокирующем буфере непосредственно держатель слайдов, содержащий белок micorarrays и закрывать верхнюю с парафином, чтобы предотвратить утечку. Блок массивы в блокирующем буфере в течение 1 часа при встряхивании при 50 оборотах в минуту на стадии при 4 ° С. </li><li> После блокирования передачи массивов в увлажненной камере охлаждают до 4 ° С и добавляют 90 мкл разбавленного зонда непосредственно на поверхность массива. Наложение обрн я с поднятой скольжения подъемного и инкубировать статическое (не встряхивая) в увлажненной камере при 4 ° С в течение 1,5 ч. </li><li> Вымойте массивы 3 раза в течение 1 мин каждый в буфере зонда в трех 50 мл конические пробирки. Добавить слайд, конических пробирок, содержащих достаточно предварительно охлажденной буфера зонд полностью конверт слайд. Разрешить скольжения ручка мягко соскальзывать микрочипов белка (не заставить ее покинуть, как это может привести к повреждению поверхности массива). </li><li> Нанесите раствор антител непосредственно в массив сразу после завершения стирки (этап 2.5) и накладку с поднятым скольжения подъемного как раньше. Инкубируйте массивов в течение 30 мин при 4 ° С в увлажненной камере. </li><li> Точно так же следует стадия промывки, как и раньше (3 раза 1 мин в буфере зонда) и спина в 50 мл коническую пробирку при 800 х г в настольной центрифуге в течение 5 мин при комнатной температуре. Высушите массивов в держатель слайдов в темноте в течение 30 мин перед сканированием массива на 647 нм. </li></ol>

<ol>
	<li>Fasolo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+protein+kinase+interactions+identified+by+protein+microarrays+reveal+novel+connections+between+cellular+processes.">Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes.</a> Genes. 25, 767-778 (2011).</li><li>Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProCAT:+a+data+analysis+approach+for+protein+microarrays.">ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays.</a> Genome biology. 7, R110 (2006).</li><li>Breitkreutz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+protein+kinase+and+phosphatase+interaction+network+in+yeast.">A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast.</a> Science. 328, 1043-1046 (2010).</li><li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes.">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415, 141-147 (2002).</li><li>Jeong, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+monospecific+monoclonal+antibodies+using+a+human+proteome+microarray.">Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).</li><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440, 637-643 (2006).</li><li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays.">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips.">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293, 2101-2105 (2001).</li><li>Ptacek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+phosphorylation+in+yeast.">Global analysis of protein phosphorylation in yeast.</a> Nature. 438, 679-684 (2005).</li><li>Haab, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+arrays+in+cancer+research.+Molecular+&amp;+cellular+proteomics.">Antibody arrays in cancer research. Molecular &amp; cellular proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (4), 377-383 (2005).</li><li>Kopf, E., Zharhary, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+arrays--an+emerging+tool+in+cancer+proteomics.">Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 39, 1305-1317 (2007).</li><li>Berrade, L., Garcia, A. E., Camarero, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+microarrays:+novel+developments+and+applications.">Protein microarrays: novel developments and applications.</a> Pharmaceutical research. 28, 1480-1499 (2011).</li><li>Balboni, I., Limb, C., Tenenbaum, J. D., Utz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+microarray+surfaces+and+arraying+parameters+for+autoantibody+profiling.">Evaluation of microarray surfaces and arraying parameters for autoantibody profiling.</a> Proteomics. 8, 3443-3449 (2008).</li><li>Gelperin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection.">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes &amp; development. 19, 2816-2826 (2005).</li><li>Fasolo, J., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+microarrays.">Protein microarrays.</a> Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).</li><li>Im, H., Snyder, M., Coligan, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+recombinant+protein+spotted+arrays+for+proteome-wide+identification+of+kinase+targets.">Preparation of recombinant protein spotted arrays for proteome-wide identification of kinase targets.</a> Current protocols in protein science. 27, Unit 27 24 (2013).</li><li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination.">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science. 289, 1760-1763 (2000).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Протокол, представленные первоначально был выполнен с использованием 85 уникальных дрожжей белка белки киназы-V5 фьюжн сравнить активность связывания через отдельных и связанных семей дрожжи протеинкиназ в результате идентификации новых сетей киназы взаимодействия в естественных ...

Необходимость проведения глобальных анализов биохимии белков и активность связывания в естественных условиях привело к разработке новых методов профилирования белок-белковых взаимодействий (ИЦП) и пост-трансляционные модификации целых протеомов 1,3-8. Белковые микрочипы изготавливаются в качестве функциональных белковых микрочипов с использованием полноформатных функциональные белки 4-6,8,9 или аналитических белковых микрочипов, содержащих антитела 10,11. Они разработаны, чтобы содержать высокой плотности белков, выстроенных на предметных стеклах с различными поверхностных химических для облегчения различных экспериментальных условиях, необходимых для проведения широкомасштабную биохимических анализов 12. Нитроцеллюлозы и альдегид поверхности химические для химической привязанности через лизина или крепления близость методов, таких как никель хелатных слайдов для крепления His-меченных белков и глутатиона для аффинной привязанности среди других 13. </p&gt; Использование функциональных белковых микрочипов для выявления белок-белковых взаимодействий требуется доступ к высококачественной библиотеки функционального белка 14. С. Cerevisiae поддается производить такой библиотеки через спаривания высокого сродства копирования меченый белок конструкции с высокой пропускной методов хроматографического очистки. Подавляющее большинство генома дрожжей было последовательности и почти вся протеом может быть выражена с высокой копирования плазмиды для очистки и биохимический анализы 12. После того, как белки получают и облеченные в формате 384-луночного, они напечатаны на предметное стекло микроскопа, позволяющего для быстрого параллельного многопараметрического биохимического анализа и биоинформатики допроса 8,14-16. Белковые микрочипы были использованы для ферментативных анализов и взаимодействий с белками, липидами, малых молекул, и нуклеиновых кислот среди многих других приложений. Доступность белков на поверхности протеомамассивы сделать их поддаются различным видам аналитического обнаружения в том числе, иммунных сродством, поверхностного плазмонного резонанса, флуоресценцию и многие другие методы. Кроме того, она позволяет точного контроля экспериментальных условиях, где он может быть трудно сделать в естественных условиях. Цель этого протокола заключается в демонстрации соответствующего использования функциональных белковых микрочипов для выявления белок-белковых взаимодействий. Это приложение позволяет с высокой пропускной параллельный биохимический анализ белка связывания деятельности с использованием высокоочищенного анализируемого (белок) интересов. С-концевой (карбокси-терминал) помечены V5-фьюжн приманки интерес белок получают из высокого плазмидой в штамме дрожжей, оптимизированной для очистки белков. С-концевой пометки гарантирует, что белок полной длины была переведена. Белок, используемый в данном исследовании, Tda1-V5 слитый белок киназы, который очищают с помощью аффинной никель смолы с помощью тэга His6X. Tda1-V5 слияние строит очищали путем последовательного элюирования с использованием градиента имидазола для элюирования наиболее обогащенную фракцию для использования в анализе.

<table><tbody><tr><td>Petri Dishes</td><td>VWR</td><td>NC-10747</td><td>or comparable</td></tr><tr><td>Bacto yeast extract</td><td>Difco</td><td>0217-17</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptone</td><td>Difco</td><td>0118-17</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>Difco</td><td>0140-01</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>Raffinose</td><td>Sigma</td><td>R0514</td><td></td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Sigma</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>Sc-Ura drop out media</td><td>MP Bio</td><td>114410622</td><td></td></tr><tr><td>Small Culture tubes</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Large Erlenmeyer Flask</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge JA-10 rotor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes (500 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon tube (50 ml)</td><td>VWR/Fisher</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>PBS Tablets</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep Tubes (2 ml screw cap tube)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FastPrep Machine</td><td>MP Biomedicals</td><td>116004500</td><td></td></tr><tr><td>Zircon Beads</td><td>BioSpec</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M8266&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole (pH = 7.4)</td><td>Sigma</td><td>I5513&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>93482</td><td></td></tr><tr><td>Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free)</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase inhibitor cocktail 1</td><td>sigma</td><td>P2850</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A1852&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Shaking Incubator (30 &amp;deg;C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nickel Affinity Resin</td><td>Life Technologies</td><td>R901-01</td><td></td></tr><tr><td>G25 column</td><td>GE life sciences</td><td>27-5325-01&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Gel (NuPage)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue Stain</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal V5 Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>R960-25</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>451098</td><td></td></tr><tr><td>Protein Microarrays Kit</td><td>Life Technologies</td><td>PAH0525013</td><td></td></tr><tr><td>Genepix Scanner</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lifter Slips</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/</td></tr><tr><td>Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT,&lt;br/&gt; 2 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail &amp;ndash; EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF&amp;nbsp; (add just prior to use)</td><td></td><td></td><td>Add the reagents to 1x PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution</td></tr><tr><td>Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20</td><td></td><td></td><td>Add the reagents to 1x PBS to obtain the desired volume of blocking buffer</td></tr><tr><td>Probe Buffer: 2 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 &amp;mu;M ATP (for kinases), 1% BSA</td><td></td><td></td><td>Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer</td></tr><tr><td>Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer</td></tr><tr><td>Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 500 mM NaCl, 50 &amp;ndash; 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail &amp;ndash; EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use)</td><td></td><td></td><td>Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 &amp;ndash; 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer</td></tr><tr><td>3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and&amp;nbsp; 60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol)</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;Galactose should not be autoclaved</td></tr></tbody></table>

probing high-density functional protein microarrays to detect protein-protein interactions

Функциональный белок-микрочипов высокой плотности, содержащие ~ 4200 рекомбинантные белки дрожжей проверяются на киназы белок-белковых взаимодействий с использованием гибридного белка аффинной очистке дрожжи киназы, содержащий тег V5-эпитоп для считывания. Очищенный киназа получена через культуры штамма дрожжей, оптимизированной для производства белка с высоким копирования содержащего плазмиду, содержащую слитый киназы-V5 построить под GAL индуцируемого промотора. Дрожжи выращивали в средах с ограничительной нейтрального источника углерода в течение 6 ч, затем по индукции с 2% галактозы. Далее, культура собирают и киназы очищают с использованием стандартных аффинных хроматографических методов для получения высокоочищенного протеинкиназу для использования в анализе. Очищенный киназы разбавляют киназного буфера с соответствующим диапазоном для анализа и белковых чипов заблокированы до гибридизации с белком микрочипов. После гибридизации, массивы зондируют моноклональное V5 АнтибODY для идентификации белков, связанных с протеинкиназой V5. Наконец, массивы будут отсканированы с использованием стандартных микрочипов сканер, и данные извлекаются для анализа вниз по течению информатики 1,2, чтобы определить высокое доверие набор белковых взаимодействий для последующего утверждения в естественных условиях.

Активность белок-белковое взаимодействие наблюдалось с помощью стандартного считывателя чип оценить Tda1-V5 протеинкиназы слитой конструкции в качестве приманки против белка функциональной микрочипов белка дрожжей, содержащего приблизительно 4,200 уникальную S. Cerevisiae GST-слитые белк...

Watch this Scientific Journal Video about Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions at JoVE.com

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Использование белковых микрочипов, содержащих почти всю С. Cerevisiae протеом зондируют для быстрого объективной допроса тысяч белок-белковых взаимодействий в параллель. Этот метод может быть использован для белка-малая молекула, посттрансляционной модификации, и других анализов в высокой пропускной.

Исследование высокой плотности белковых Функциональные Microarrays для обнаружения белок-белковых взаимодействий

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

probing-high-density-functional-protein-microarrays-to-detect-protein

Research

JoVE Journal

Biology

8.0K Views.  Stanford University.  Использование белковых микрочипов, содержащих почти всю С. Cerevisiae протеом зондируют для быстрого объективной допроса тысяч белок-белковых взаимодействий в параллель. Этот метод может быть использован для белка-малая молекула, посттрансляционной модифи...

Video: Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling cascades during homeostasis and disease, and as such represent prime therapeutic targets. Despite their relevance, these interaction networks remain significantly underrepresented in current databases; therefore, most extracellular proteins have no documented binding partner. This discrepancy is primarily due to the challenges associated with the study of the extracellular proteins, including expression of functional proteins, and the weak, low affinity, protein interactions often established between cell surface receptors. The purpose of this method is to describe the printing of a library of extracellular proteins in a microarray format for screening of protein-protein interactions. To enable detection of weak interactions, a method based on multimerization of the query protein under study is described. Coupled to this microbead-based multimerization approach for increased multivalency, the protein microarray allows robust detection of transient protein-protein interactions in high throughput. This method offers a rapid and low sample consuming-approach for identification of new interactions applicable to any extracellular protein. Protein microarray printing and screening protocol are described. This technology will be useful for investigators seeking a robust method for discovery of protein interactions in the extracellular space.

Here, we present a protocol to screen extracellular protein microarrays for identification of novel receptor-ligand interactions in high throughput. We also describe a method to enhance detection of transient protein-protein interactions by using protein-microbead complexes.

Внеклеточный протеин технология Microarray для высокой пропускной способности обнаружения низкого сродства рецептор лиганд взаимодействий

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Biochemistry

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Сравнительный подход к характеризации Пейзаж хозяин-патоген белок-белковых взаимодействий

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Immunology and Infection

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

В естественных условиях обнаружения белок-белковых взаимодействий на микро-узорной поверхности

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

Химически заблокирован антител Microarray для мультиплексный высокой пропускной профилирования конкретных гликозилирования белков в сложных образцов

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

Открывая белковых взаимодействий и Характеризуя Protein функций с помощью HaloTag технологии

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Выявление белок-белковых сайтов взаимодействие по пептидов массивов

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

Генома белок-белковых Взаимодействие Скрининг белком-фрагментом комплементации анализа (РСА) в живых клетках

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Высокочувствительное детектирование связывания соединения с белком с помощью флуоресценции

Detection of CD40 Protein-Umbelliferone Interaction via Differential Scanning Fluorescence

The investigation of interactions between different molecules is a crucial aspect of understanding disease pathogenesis and screening for drug targets. Umbelliferone, an active ingredient in Tibetan medicine Vicatia thibetica, exhibits an immunomodulatory effect with an unknown mechanism. The CD40 protein is a key target in the immune response. Therefore, this study employs the principle of differential scanning fluorescence technology to analyze the interactions between CD40 protein and umbelliferone using fluorescent enzyme markers. Initially, the stability of the protein fluorescent orange dye was experimentally verified, and the optimal dilution ratio of 1:500 was determined. Subsequently, it was observed that the temperature melting (Tm) value of CD40 protein tended to decrease with an increase in concentration. Interestingly, the interaction between CD40 protein and umbelliferone was found to enhance the thermal stability of CD40 protein. This study represents the first attempt to detect the binding potential of small molecule compounds and proteins using fluorescence microplates and fluorescent dyes. The technique is characterized by high sensitivity and accuracy, promising advancements in the fields of protein stability, protein structure, and protein-ligand interactions, thus facilitating further research and exploration.

В центре внимания автора: Оптимизация методов ПЦР для повышения доступности и эффективности

This protocol describes a unique method for detecting the binding between compounds and protein molecules, offering the advantages of minimal protein sample loss and high data accuracy.

Детектирование взаимодействия белка CD40 с умбеллифероном с помощью дифференциальной сканирующей флуоресценции

The investigation of interactions between different molecules is a crucial aspect of understanding disease pathogenesis and screening for drug targets. ...

Исследование высокой плотности белковых Функциональные Microarrays для обнаружения белок-белковых взаимодействий

Резюме

Смотреть дополнительные видео

PLAYLIST