This work was supported by the Seed Grant Award from California Northstate University College of Pharmacy (to AMN). The authors would like to thank California Northstate University College of Pharmacy for covering the publication cost of this article, and George Talbott for his help in editing this manuscript.

1. Техническое обслуживание Сасо-2 клетки <ol><li> Использование регулярных культуры ткани блюда <ol><li> Растаяйте клеток Сасо-2 из замороженного флакон, поместив флакон в водяную баню при 37 °, и сразу же добавить их в 10 см блюдо культуры ткани, содержащей 10 мл предварительно нагретой питательной среды (15% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS ) в Игла в модификации Дульбекко (DMEM)). <ol><li> Когда клетки Сасо-2 достигли 50-70% слияния, разделить их 1: 6 инкубацией клеток с 3 мл 0,05% трипсина / 0,53 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) при 37 ° С, пока они не отделены (15 мин) , Чтобы избежать образования комков клеток, смешать клеткам несколько раз осторожно пипеткой. Добавить 0,5 мл трипсином клетки в 10 см блюдо культуры ткани, содержащей 10 мл предварительно нагретой питательной среды. </li></ol></li><li> Слегка встряхните посуду несколько раз в прямом и обратном направлении, а затем в влево и вправо направлении. Избегайте закрученного блюдатак как это может привести к неравной дисперсии клеток. </li><li> Поместите посуду на плоской поверхности в 37 ° C инкубатора поставляется с 5% CO 2. Наклонные поверхности могут также привести к неравной дисперсии клеток. </li><li> Изменить питательных сред на следующий день после начала инкубации. </li><li> Монитор клетки и записывать день они достигают слияния. Это займет около 1 недели для клеток, чтобы достичь слияния со дня их разделить. </li><li> Замените носитель роста в два раза за неделю до клетки достигают слияния. После того, как клетки достигли слияния, изменить питательной среды через день. После клетки 7 дней после сливной измените носитель роста в день. Примечание: клетки готовы для экспериментов, когда они 13-дней после сливающихся (Рисунок 1). Поскольку клетки в конечном итоге становятся менее эффективными в производстве липопротеинов, использовать клетки, которые находятся между 13 до 17 дней после сливающихся 8. Перейдите к шагу 3 о том, как проводить эксперимент.</li></ol></li><li> Использование проницаемых мембран систему <ol><li> Семени клеток Сасо-2 в мембрану вставки, как описано в шаге 1.1.1.1. выше. Избегайте использования клеток из замороженного флаконе, поскольку их рост клеток, как правило, медленнее (период восстановления). Вкратце, добавить 0,5 мл трипсином клеток в апикальную камеру (верхний отсек), который содержит 10 мл предварительно нагретой питательной среды. Кроме того, добавьте 10 мл подогретого СМИ роста на базолатеральную камеры (нижний отсек). Примечание: Для лучшей практике, добавить питательную среду в апикальную камеру, а затем в базолатеральной камере. При удалении старых СМИ, удалить базолатеральный СМИ перед верхушечных СМИ. Избегайте тыкать поликарбоната мембраны, как это может привести к разрыву мембраны. </li><li> Из-за плохой видимости клеток через поликарбонатную мембрану, семена ЦАС-2 клетки в регулярном блюдо культуры ткани с одинаковой плотности, и использовать это блюдо, чтобы судить клеток слияния. </li><li> Следуйте ейТЭЦ 1.1.2-1.1.6 выше. </li></ol></li></ol> 2. Джин Избыточная <ol><li> Использование регулярных подход трансфекции <ol><li> Семенной ЦАС-2 клеток на ткани блюдо культуры, как описано в 1.1.1.1.-1.1.4 выше. Примечание: Когда клетки около 40-50% сливной, они готовы для трансфекции. </li><li> Добавить 67 мкл реагента для трансфекции в 472 мкл восстановленных в сыворотке СМИ в микроцентрифужных трубки. Избегайте контакта неразбавленного трансфекции реагента со стенкой трубы. </li><li> Добавить 23 мкг pLL3.7 усиливается зеленый флуоресцентный белок (EGFP), 9 в трансфекции реагента / восстановленной смеси сыворотки СМИ. </li><li> Выдержите смесь в течение 20 мин при комнатной температуре. </li><li> Замените питательной среды клеток Сасо-2 &quot;с 8 мл 10% FBS в DMEM. </li><li> Добавьте ДНК / реагента для трансфекции / уменьшается в сыворотке СМИ смесь по каплям к блюду. </li><li> Слегка встряхните посуду несколько раз в прямом и баckward направлении, а затем в влево и вправо направлении. </li><li> Поместите блюдо в 37 ° C инкубатора. </li><li> Замените СМИ в блюдо с 10 мл питательной среды день после начала инкубации. </li><li> Монитор экспрессию генов. <ol><li> Монитор экспрессию гена без 4 &#39;, 6-диамидино-2-фенилиндол окрашивания (DAPI). Использование флуоресцентного микроскопа, определить процент клеток, которые зеленый. Процент представляет эффективность трансфекции. </li><li> Монитор экспрессию гена с окрашиванием DAPI. <ol><li> Промыть клеток фосфатно-солевым буфером (PBS) в три раза. </li><li> Зафиксировать клетки добавлением 10 мл 4% формальдегида в PBS (10 мин инкубации при комнатной температуре). </li><li> Промыть клеток с PBS три раза. </li><li> Инкубируйте клетки в темноте в течение 15 мин при комнатной температуре с 8 мл PBS, содержащим 1: 500 DAPI, 1% БСА, 0,01% дигитонина. </li><li> Промыть клеток с PBS три раза. </li><li> Uпеть флуоресцентного микроскопа, определить количество клеток, которые зеленый / синий отношению к тем, которые являются синий (Рисунок 2 верхняя панель). Рассчитанная процент представляет эффективность трансфекции. </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Использование системы лентивирус избыточная экспрессия 10 <ol><li> Семенной человека эмбриональной почки (НЕК) 293T клетки в 15 см блюдо культуры ткани (10% FBS, в DMEM как их питательной среды). Примечание: Когда клетки около 60-70% сливной, они готовы для трансфекции. </li><li> Добавить 162 мкл реагента для трансфекции в 1133 мкл восстановленных в сыворотке СМИ в микроцентрифужных трубки 11. Избегайте контакта неразбавленного трансфекции реагента со стенкой трубы. </li><li> Добавить 24 мкг pLL3.7 EGFP (или другой конструкта), 15,6 мкг Rev элемент ответа (РРЭ), 6,0 мкг REV и 8.4 мкг вируса везикулярного стоматита гликопротеина (VSVG) в трансфекции реагента / гразвита сыворотки СМИ смесь. </li><li> Выдержите смесь в течение 20 мин при комнатной температуре. </li><li> Замените СМИ роста с 16 мл 10% FBS в DMEM. </li><li> Добавьте ДНК / реагента для трансфекции / уменьшается в сыворотке СМИ смесь по каплям к блюду. </li><li> Слегка встряхните посуду несколько раз в прямом и обратном направлении, а затем в влево и вправо направлении. Это нормально, чтобы увидеть некоторые из HEK293T клеток отдельных в этой точке. </li><li> Поместите блюдо в инкубаторе. </li><li> После 24 часов инкубации, заменить носитель в чашке с 25 мл питательной среды. </li><li> На следующий день, собирать средства массовой информации роста, содержащий лентивирус (первый сбор). </li><li> Повторите шаг 2.2.10, чтобы собрать больше лентивирус (вторая коллекция). </li><li> Бассейн первый и второй сборник, и удалить остатков клеток путем центрифугирования (2500 мкг в течение 5 мин). </li><li> Фильтр сбора с одноразовые бутылки верхней фильтра (0,45 мкм пор), исконцентрировать вирус центрифугированием сбор на 31400 х г в течение 2 ч при комнатной температуре (JA-20) ротора. Отметить дно центрифужную пробирку, где осадок находится. Декантировать супернатант, и оставить трубу перевернутой при комнатной температуре в течение примерно 15 мин. </li><li> Ресуспендируют содержащую вирус осадок 100 мкл 1X PBS. Избегайте пузырей. </li><li> Хранить концентрированный вирус при -80 ° С. Избегайте циклов замораживания-оттаивания. </li><li> Определить оптимальное количество вируса необходимое для трансдукции клеток Сасо-2 путем титрования. Чтобы сохранить стоимость, использовать 24-луночного планшета (0,3 мл питательной среды / лунка) вместо 10 см культуре ткани блюдо для титрования. <ol><li> Добавить большее количество концентрированного вируса (0, 1, 2, 5, 10, 25, и 50 мкл / лунку), дополненной полибреном (конечная концентрация = 5 мкг / мл) в 40-70% сплошности клеток Сасо-2. Встряхнуть тарелку 24-а нежно, как описано в 1.1.2. </li><li> Монитор их экспрессию генов (шаг 2.1.10.) (Рис 2 снизу4 панели). </li></ol></li><li> Так выражение трансгена, как правило, поддерживается, поддерживать трансдуцированных клеток для будущих экспериментов и постоянно следить за их экспрессию генов (шаг 2.1.10.). </li></ol></li></ol> 3. Стимулирование липопротеина секрецию <ol><li> Использование регулярных блюдо культуры ткани <ol><li> Подготовка смеси липидов 100X путем смешивания 50 мг олеиновой кислоты, 40 мг лецитина и 48 мг таурохолата натрия. Довести объем до 900 мкл с PBS (достаточно для 8 блюд). Vortex липидной смеси энергично. </li><li> Добавить 900 мкл липидной смеси 100X в 89,1 мл питательной среды. Смешайте и фильтровать липидов, содержащих носители. Конечные концентрации (1x) олеиновой кислоты, лецитин, и таурохолата натрия 2,0 мМ, 1,36 мМ и 1,0 мМ, соответственно. </li><li> Добавьте 10 мл липидной-содержащей среде с клетками. </li><li> Инкубируйте клетки с липидными-содержащей среде в течение 4 ч в 37° C инкубатор. </li><li> Промыть клеток с PBS три раза. </li><li> Добавьте 10 мл питательной среды к клеткам, чтобы собрать секрецию липопротеинов. </li><li> Инкубируют в течение 2 ч в 37 ° C инкубаторе. </li><li> Соберите липопротеинов, содержащих носители. </li></ol></li><li> Использование проницаемых мембран систему <ol><li> Выполните шаги 3.1.1-3.1.2 подготовить липидной смеси. </li><li> Добавьте 10 мл липидного средах, содержащих в апикальную камеру и 10 мл питательной среды в базолатеральной камере. </li><li> Инкубируют в течение 4 ч в 37 ° C инкубаторе. Соберите липопротеинов, содержащих средств массовой информации в базолатеральной камере. </li></ol></li></ol> 4. Выделение липопротеинов (рисунок 3) <ol><li> Удалить остатков клеток от липопротеинов, содержащих сред центрифугированием (2000 х г в течение 5 мин). </li><li> Слейте СМИ в 50 мл трубки. </li><li> Добавить 5,95 г хлорида натрия в средствах массовой информации. </li><li> Если SAmple будут проанализированы ТЕА, добавить 1 ингибитор протеазы коктейль таблетки для поддержания целостности липопротеинов. </li><li> Довести объем до 23 мл с водой (1,2 г / мл NaCl плотность раствора). </li><li> Растворите растворенные вещества полностью. </li><li> Декантировать весь раствор в ультрацентрифужную пробирку из поликарбоната. </li><li> Осторожно накладывать плотность раствора 1,2 г / мл с 0,5 мл воды (1,0 г / мл) плотности. </li><li> Баланс трубки по весу, а не по объему. </li><li> Аккуратно загрузите пробирки в T865 ротора. </li><li> Спин образцов в ультрацентрифуге при 429460 х г в течение 24 ч при 4 ° С. </li><li> Сразу изолировать верхнюю 0,5 мл раствора, осторожно пипеткой. Держите трубку, как до сих пор, как это возможно. </li></ol> 5. Анализ ПЭМ <ol><li> Подготовка 5 мл 2% фосфовольфрамовой кислоты (вес / объем) и доведения рН до 6,0. </li><li> Фильтр 2% фосфовольфрамовой кислоты с помощью шприца фильтра (размер пор: 0,2 мкм). </li><li> Падение 20 мкл образца липопротеинов на стерильную чашку. </li><li> Падение 20 мкл фильтрованного 2% фосфовольфрамовой кислоты рядом с образцом на одной тарелки. </li><li> Аккуратно падение ЭМ сетки с тупой стороны отдыхает на образце. </li><li> Выдержите при комнатной температуре в течение 1 мин. </li><li> Аккуратно нажмите на сторону сетки ЭМ на фильтровальной бумаге, чтобы удалить образец из сетки. </li><li> Осторожно опустить EM сетки с тупой стороны отдыхает на 2% фосфорно кислоты. </li><li> Выдержите при комнатной температуре в течение 1 мин. </li><li> Аккуратно нажмите на стороне сетки ЭМ на фильтровальной бумаге, чтобы удалить фосфовольфрамовой кислоты из сетки. </li><li> Использование ПЭМ, захватить изображения липопротеинов (рисунок 4). </li></ol>

<ol>
	<li>Drover, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD36+deficiency+impairs+intestinal+lipid+secretion+and+clearance+of+chylomicrons+from+the+blood.">CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood.</a> J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).</li><li>Nauli, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD36+is+important+for+chylomicron+formation+and+secretion+and+may+mediate+cholesterol+uptake+in+the+proximal+intestine.">CD36 is important for chylomicron formation and secretion and may mediate cholesterol uptake in the proximal intestine.</a> Gastroenterology. 131 (4), 1197-1207 (2006).</li><li>Nauli, A. M., Zheng, S., Yang, Q., Li, R., Jandacek, R., Tso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+alkaline+phosphatase+release+is+not+associated+with+chylomicron+formation.">Intestinal alkaline phosphatase release is not associated with chylomicron formation.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284 (4), G583-G587 (2003).</li><li>Lo, C. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+does+the+gut+choose+apolipoprotein+B48+but+not+B100+for+chylomicron+formation.">Why does the gut choose apolipoprotein B48 but not B100 for chylomicron formation.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G344-G352 (2008).</li><li>Jandacek, R. J., Heubi, J. E., Tso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+noninvasive+method+for+the+measurement+of+intestinal+fat+absorption.">A novel, noninvasive method for the measurement of intestinal fat absorption.</a> Gastroenterology. 127 (1), 139-144 (2004).</li><li>Nauli, A. M., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+transport+as+a+potential+determinant+of+drug+bioavailability.">Intestinal transport as a potential determinant of drug bioavailability.</a> Curr Clin Pharmacol. 8 (3), 247-255 (2013).</li><li>Tso, P., Nauli, A., Lo, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterocyte+fatty+acid+uptake+and+intestinal+fatty+acid-binding+protein.">Enterocyte fatty acid uptake and intestinal fatty acid-binding protein.</a> Biochem Soc Trans. 32 (Pt 1), 75-78 (2004).</li><li>Nauli, A. M., Sun, Y., Whittimore, J. D., Atyia, S., Krishnaswamy, G., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chylomicrons+produced+by+Caco-2+cells+contained+ApoB-48+with+diameter+of+80-200+nm.">Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm.</a> Physiol Rep. 2 (6), (2014).</li><li>Rubinson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells,+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference.">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nat Genet. 33 (3), 401-406 (2003).</li><li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system.">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031 (2012).</li><li>Pottekat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+biosynthetic+interaction+network+component,+TMEM24,+facilitates+insulin+reserve+pool+release.">Insulin biosynthetic interaction network component, TMEM24, facilitates insulin reserve pool release.</a> Cell Rep. 4 (5), 921-930 (2013).</li><li>Van Greevenbroek, M. M., van Meer, G., Erkelens, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+saturated,+mono-,+and+polyunsaturated+fatty+acids+on+the+secretion+of+apo+B+containing+lipoproteins+by+Caco-2+cells.">Effects of saturated, mono-, and polyunsaturated fatty acids on the secretion of apo B containing lipoproteins by Caco-2 cells.</a> Atherosclerosis. 21 (1), 139-150 (1996).</li><li>Levy, E., Yotov, W., Seidman, E. G., Garofalo, C., Delvin, E., M&#233;nard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caco-2+cells+and+human+fetal+colon:+a+comparative+analysis+of+their+lipid+transport.">Caco-2 cells and human fetal colon: a comparative analysis of their lipid transport.</a> Biochim Biophys Acta. 1439 (3), 353-362 (1999).</li><li>Luchoomun, J., Hussain, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+secretion+of+chylomicrons+by+differentiated+Caco-2+cells.+Nascent+triglycerides+and+preformed+phospholipids+are+preferentially+used+for+lipoprotein+assembly.">Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly.</a> J Biol Chem. 274 (28), 19565-19572 (1999).</li></ol>

The author has nothing to disclose.

В этой статье, эти две системы, которые могут быть использованы для поддержания Сасо-2 клетки описаны, а именно, регулярные блюдо культуры тканей и мембрану. Преимущества с использованием проницаемой мембраны системы включают в себя разделение апикального и базолатеральной отсеки, а т?...

Исследования кишечной абсорбции пищевых жиров и жирорастворимых лекарственных препаратов и витаминов может быть проведена в естественных условиях с помощью свища модель лимфатических 1 - 4. Тем не менее, хирургические методы, вовлеченные не только сложно, но и дорого. Хотя в естественных условиях подходы, основанные на анализе фекальной может быть использован, они используются в основном для определения поглощение процентов от желудочно-кишечного тракта 2,5. Модель в пробирке описано в этой статье является более экономически эффективным, и методы, связанные, возможно, являются менее сложным. Генетические исследования модификации также более экономичным и менее трудоемким, когда они выполняются с использованием этой модели ин витро. Так липидорастворимые материалы, которые принимаются до энтероцитами упакованы в липопротеинов 6,7, эффективность этой модели в пробирке, чтобы произвести липопротеины очень важно. Два основных intestinaл липопротеины хиломикронов и очень низкой плотности (ЛПОНП). Chylomicrons, определенные как липопротеинов с 80 нм или более в диаметре, получают строго в тонком кишечнике, когда липиды в большом количестве присутствуют в желудочно-кишечном просвете. Так как они являются крупнейшими липопротеины, хиломикроны являются очевидно наиболее эффективные транспортеры липидов. Эта модель в пробирке, который способен производить хиломикроны 8, может быть использован для изучения диетическое всасывание жира, жирорастворимых витаминов поглощения в кишечнике и полости рта липофильный биодоступность лекарства. Наличие жирорастворимых молекул, витаминов, лекарственных препаратов или в фракции липопротеинов является показателем их абсорбции в тонком кишечнике. Как обсуждалось ранее, эта модель может быть использована, чтобы улучшить пероральную биодоступность лекарства липофильный 6. Эта статья описывает, как клетки Сасо-2 должна быть сохранена в мембрану или регулярных культуры ткани блюд, то как липидные миxture для стимулирования производства липопротеинов должны быть подготовлены, как лентивирусов система экспрессии может быть использован для достижения эффективной сверхэкспрессии, и как изолированного липопротеины должны быть проанализированы.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16750-112</td>
			<td>Pre-warm the growth media in individual tissue culture dish before adding cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>3600511</td>
			<td>We do not heat inactivate our serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-660</td>
			<td>Cells can be washed with PBS prior to trypsin treatment&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeable membrane system</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7200173</td>
			<td>10-cm dish, 3-mm pore size, polycarbonate membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-E</td>
			<td>Tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-24</td>
			<td>Tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12565163</td>
			<td>Tissue culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid-based transfection reagent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PRE2691</td>
			<td>Can be substituted with other transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11058021</td>
			<td>For transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLL3.7 eGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11795</td>
			<td><a href="https://www.addgene.org/11795/">https://www.addgene.org/11795/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-top filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9761120</td>
			<td>0.45 mm pore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9840454</td>
			<td>10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01383-5G</td>
			<td>Prevent freeze-thaw cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lecithin&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>IC10214625</td>
			<td>Egg lecithin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium taurocholate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9620276</td>
			<td>Product discontinued; alternative catalog number: 50-121-7956</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablet (EDTA-free)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5892791001</td>
			<td>Used mainly for samples that need TEM analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultracentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9696153</td>
			<td>Reusing it multiple times will collapse the tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lid for ultracentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9796914</td>
			<td>A tool is required to remove the tube/lid from rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-949-261</td>
			<td>Disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-719C</td>
			<td>Pore size = 0.2 mm; nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC208310250</td>
			<td>For preparing 2% phosphotungstic acid, pH 6.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-238-62</td>
			<td>Extra fine and strong tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/carbon grid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-260-34</td>
			<td>Formvar/carbon film square grid 400 Copper</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using caco-2 cells to study lipid transport by the intestine

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely accepted as the in vivo model of dietary fat absorption, the surgical techniques involved are challenging and expensive. Genetic manipulation of the animal model is also costly and time consuming. The alternative in vitro model is arguably more affordable, timesaving, and less challenging. Importantly, the in vitro model allows investigators to examine the enterocytes as an isolated system, reducing the complexity inherent in the whole organism model. This paper describes how human colon carcinoma cells (Caco-2) can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs and vitamins. It explains the proper maintenance of Caco-2 cells and the preparation of their lipid mixture; and it further discusses the valuable option of using the permeable membrane system. Since differentiated Caco-2 cells are polarized, the main advantage of using the permeable membrane system is that it separates the apical from the basolateral compartment. Consequently, the lipid mixture can be added to the apical compartment while the lipoproteins can be collected from the basolateral compartment. In addition, the effectiveness of the lentivirus expression system in upregulating gene expression in Caco-2 cells is discussed. Lastly, this paper describes how to confirm the successful isolation of intestinal lipoproteins by transmission electron microscopy (TEM).

На рисунке 1 представлены нормальные 13-дней после сливной Сасо-2 клетки. Появление куполообразных структур и капель внутриклеточных липидов характерны дифференцированных клеток Сасо-2. Когда клетки Сасо-2 не разошлись одинаково во посева, они будут группироваться и зарастают ?...

Watch this Scientific Journal Video about Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine at JoVE.com

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

Использование CaCO 2-Cells по изучению транспорта липидов в кишечнике

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

using-caco-2-cells-to-study-lipid-transport-by-the-intestine

Research

JoVE Journal

Biology

18.7K Views.  California Northstate University. Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

Video: Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Тестирование зрительной чувствительности к скорости и направления движения в Ящерицы

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

Компьютерные Стимулы животной модели

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Выделение и очистка Drosophila Периферийные Нейроны магнитными бисера Сортировка

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Использование optokinetic ответ на исследование зрительной функции данио

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

Измерение Катионит транспорта по Na, K и H, K-АТФазы<em&gt; Xenopus</em&gt; Ооцитов методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии: Альтернатива радиоизотопных Анализы

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

The intestinal epithelium has important transport and barrier functions that play key roles in normal physiological functions of the body while providing a barrier to foreign particles. Impaired epithelial transport (ion, nutrient, or drugs) has been associated with many diseases and can have consequences that extend beyond the normal physiological functions of the transporters, such as by influencing epithelial integrity and the gut microbiome. Understanding the function and regulation of transport proteins is critical for the development of improved therapeutic interventions. The biggest challenge in the study of epithelial transport is developing a suitable model system that recapitulates important features of the native intestinal epithelial cells. Several in vitro cell culture models, such as Caco-2, T-84, and HT-29-Cl.19A cells are typically used in epithelial transport research. These cell lines represent a reductionist approach to modeling the epithelium and have been used in many mechanistic studies, including their examination of epithelial-microbial interactions. However, cell monolayers do not accurately reflect cell-cell interactions and the in vivo microenvironment. Cells grown in 3D have shown to be promising models for drug permeability studies. We show that Caco-2 cells in 3D can be used to study epithelial transporters. It is also important that studies in Caco-2 cells are complemented with other models to rule out cell specific effects and to take into account the complexity of the native intestine. Several methods have been previously used to assess the functionality of transporters, such as everted sac and uptake in isolated epithelial cells or in isolated plasma membrane vesicles. Taking into consideration the challenges in the field with respect to models and the measurement of transport function, we demonstrate here a protocol to grow Caco-2 cells in 3D and describe the use of an Ussing chamber as an effective approach to measure serotonin transport, such as in intact polarized intestinal epithelia.

We describe simple methods to study the regulation of intestinal serotonin transporter (SERT) function and expression using an in vitro cell culture model of Caco-2 cells grown in 3D&#160;and an ex vivo model of mouse intestines. These methods are applicable to the study of other epithelial transporters.

Методы исследования эпителиальной транспортной функции белков и выражение в Native кишка и Сасо-2 клеток, выращенных в 3D

The intestinal epithelium has important transport and barrier functions that play key roles in normal physiological functions of the body while providing ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.

Смешанные первичные культуры мышиных тонкой кишки, предназначенные для изучения Gut Гормон Секреции и живых изображений клеток из клеток энтероэндокринных

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry using tethered bilayer lipid membranes (tBLMs) assembled on gold electrodes. Irradiated modified GNPs, such as streptavidin-conjugated GNPs, are embedded in tBLMs containing target molecules, such as biotin. By using this approach, the heat transfer processes between irradiated GNPs and model bilayer lipid membrane with entities of interest are mediated by a horizontally focused laser beam. The thermal predictive computational model is used to confirm the electrochemically induced conductance changes in the tBLMs. Under the specific conditions used, detecting heat pulses required specific attachment of the gold nanoparticles to the membrane surface, while unbound gold nanoparticles failed to elicit a measurable response. This technique serves as a powerful detection biosensor which can be directly utilized for the design and development of strategies for thermal therapies that permits optimization of the laser parameters, particle size, particle coatings and composition.

This work outlines a protocol to achieve dynamic, non-invasive monitoring of heat transfer from laser-irradiated gold nanoparticles to tBLMs. The system combines impedance spectroscopy for the real-time measurement of conductance changes across the tBLMs, with a horizontally focused laser beam that drives gold nanoparticle illumination, for heat production.

Привязанные двухслойные липидные мембраны для мониторинга теплопередачи между наночастицами золота и липидными мембранами

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

The Caco-2 Cell Bioassay for Measurement of Food Iron Bioavailability

Knowledge of Fe bioavailability is critical to the assessment of the nutritional quality of Fe in foods. In vivo measurement of Fe bioavailability is limited by cost, throughput, and the caveats inherent to isotopic labeling of the food Fe. Thus, there exists a critical need for an approach that is high-throughput and cost-effective. The Caco-2 cell bioassay was developed to satisfy this need. The Caco-2 cell bioassay for Fe bioavailability utilizes simulated gastric and intestinal digestion coupled with culture of a human intestinal epithelial cell line known as Caco-2. In Caco-2 cells, Fe uptake stimulates the intracellular formation of ferritin, an Fe storage protein easily measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Ferritin forms in proportion to Fe uptake; thus, by measuring Caco-2 cell ferritin production, one can assess intestinal Fe uptake from simulated food digests into the enterocyte. 
Via this approach, the model replicates the key initial step that determines food Fe bioavailability. Since its inception in 1998, this model approach has been rigorously compared to factors known to influence human Fe bioavailability. Moreover, it has been applied in parallel studies, with three human efficacy studies evaluating Fe biofortified crops. In all cases, the bioassay correctly predicted the relative amounts of Fe bioavailability from the factors, crops, and overall diet. This paper provides detailed methods on Caco-2 cell culture coupled with the in vitro digestion process and cell ferritin ELISA necessary to conduct the Caco-2 cell bioassay for Fe bioavailability.

The Caco-2 cell bioassay for iron (Fe) bioavailability represents a cost-effective and versatile approach to assess Fe bioavailability from foods, food products, supplements, meals, and even diet regimens. Thoroughly validated to human studies, it represents the state of the art for studies of Fe bioavailability.

Биоанализ клеток Caco-2 для измерения биодоступности пищевого железа

Knowledge of Fe bioavailability is critical to the assessment of the nutritional quality of Fe in foods. In vivo measurement of Fe bioavailability is ...

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

Lipid profiling, or lipidomics, is a well-established technique used to study the entire lipid content of a cell or tissue. Information acquired from&#160;lipidomics is valuable in studying the pathways involved in development, disease, and cellular metabolism. Many tools and instrumentations have aided lipidomics projects, most notably various combinations of mass spectrometry and liquid chromatography techniques. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has recently emerged as a powerful imaging technique that complements conventional approaches. This novel technique provides unique information on the spatial distribution of lipids within tissue compartments, which was previously unattainable without the use of excessive modifications. The sample preparation of the MALDI MSI approach is critical and, therefore, is the focus of this paper. This paper presents a rapid lipid analysis of a large number of Drosophila brains embedded in optimal cutting temperature compound (OCT) to provide a detailed protocol for the preparation of small tissues for lipid analysis or metabolite and small molecule analysis through MALDI MSI.

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

The aim of this protocol is to provide detailed guidance on the proper sample preparation for lipid and metabolite analysis in small tissues, such as the Drosophila brain, using matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry imaging.

Подготовка образцов для быстрого анализа липидов в мозге дрозофилы с использованием матричной лазерной десорбции / ионизационной масс-спектрометрии

Использование CaCO 2-Cells по изучению транспорта липидов в кишечнике

Резюме

Смотреть дополнительные видео

PLAYLIST