Name: bacterial artificial chromosomes: a functional genomics tool for the study of positive-strand rna viruses
Uploaded: 2015-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses at JoVE.com

The authors would like to acknowledge the Utah Science Technology and Research fund for support of YML and the Korea National Research Foundation grants (2009-0069679 and 2010-0010154) for support of SIY. This research was supported by the Utah Agricultural Experiment Station, Utah State University, and approved as journal paper number UAES #8753. Also, the authors thank Dr. Deborah McClellan for editorial assistance.

The authors have declared that they have no competing financial interests.

В настоящее время протокол был успешно использован для создания полнометражных инфекционных клонов кДНК для двух различных штаммов (CNU / LP2 27 и SA 14 -14-2 28) JEV, в флавивируса, функциональная кДНК оказалась по сути трудно построить и распространяются из клетки-хозяина токсичности и генетической нестабильности клонированной кДНК 8,74-76 Этот протокол включает в себя три основных компонента:. первых, максимизации синтеза / амплификацию кДНК точную копию вирусной РНК с помощью высококачественного воспроизведения обратной транскриптазы / ДНК-полимераза; во-вторых, клонирование вирусной PRM-E кодирующую область, содержащую токсичные последовательности (неопубликованные данные) 74,77,78 в очень низкой копирования номер вектора BAC от начальной кДНК Субклонирование к конечным полнометражных этапов сборки кДНК; в-третьих, используя клонирующий вектор BAC, которые могут вместить чужеродной ДНК со средним размером 120-350 т.п.н., 19-21, по-видимому терпит больший INSE ДНКРТС, чем другие векторы для клонирования. Это клонирование подход широко применяться в многих других положительных нити РНК вирусов, особенно тех, с большим РНК генома ~ 10 до 32 кб. Генерация инфекционного клона кДНК является ключевым шагом в развитии системы обратного генетики для РНК-содержащих вирусов, особенно для положительных нити РНК-вирусов, потому что его геном выступает в качестве вирусной мРНК, которая транслируется в белков клетки-хозяина рибосом. Таким образом, вирусная репликация может быть инициировано путем введения кДНК, полученных генома длиной молекулы РНК в восприимчивого клетке-хозяине. Наличие инфекционного клона кДНК JEV, в сочетании с технологией рекомбинантной ДНК, возросла наше понимание различных аспектов жизненного цикла вируса на молекулярном уровне, такие как экспрессии генов 73,79 и геномной репликации. 63,64 Кроме того, полнометражный JEV клон кДНК оказалась ценным инструментом для развития антивирусных вакцин и векторов 28 доставки генов. &lt;SUP&gt; 80,81 Как и со всеми положительными нити РНК-содержащих вирусов, существует множество критических этапов построения надежного функционального кДНК JEV, из которого очень заразным РНК могут быть синтезированы в пробирке. В идеале, последовательности синтетической РНК транскрибируется с клона кДНК полной длины должны быть идентичны, что из геномной РНК вируса, в частности последовательностей 5&#39;- и 3&#39;-концевых которые необходимы для инициирования вирусной репликации РНК . 60-62 В текущем протоколе, подлинный 5&#39;- и 3&#39;-концы были обеспечены путем размещения последовательность SP6 промотора перед первым аденин нуклеотидов вирусного генома и позиционирование уникальный искусственный сайт рестрикции Xba I на выходе последнего тимин нуклеотидов вирусного генома, соответственно. Игрок национальной сборной синтетических РНК с подлинным 5 &#39;и 3&#39; концах были произведены стекания транскрипцию Xba I-линеаризованной и MBN обработанной кДНК тэmplate помощью SP6 РНК-полимеразы загрунтовать с м 7 г (5 &#39;) PPP (5&#39;) колпачок аналог. Этот протокол может быть изменен несколькими способами. Для транскрипции в пробирке, другой бактериофага РНК-полимеразы (например, Т3 или Т7) может быть использован в сочетании с его четко определенной последовательностью промотора. 27 В стекания сайта, другой сайт рестрикции могут быть использованы, если его нет в вирусный геном, и если синтетические РНК из линеаризованной концов кДНК с аутентичным 3&#39;-конце. Важность нуклеотидной последовательности 3&#39;-концевого была продемонстрирована в ~ 10-кратному уменьшению РНК инфекционности при синтетической РНК содержит три или четыре вирусом связаны нуклеотидов на ее 3&#39;-конце. 27 В пробирке реакции транскрипции в оба М 7 г (5 &#39;) ррр (5&#39;) А и м 7 г (5 &#39;) ррр (5&#39;) G Крышка аналогового может быть использован в равной степени, хотя последний местах неродственного дополнительное G нуклеотид перед вирусный 5 &quot;-end, ноДобавление не изменяет инфекционность или репликации синтетической РНК. 27 Более того, удаление матрицы кДНК из РНК-транскриптов ДНКазой I пищеварения не является необходимым для РНК инфекционности испытаний, так как шаблон кДНК само по себе не инфекционное. 27 Технология ВАС в настоящее время применяется для построения инфекционных клонов кДНК для горстки положительно цепь РНК вирусов, а именно, двух Jevs, CNU / LP2 27 и SA 14 -14-2 28 (размер генома, ~ 11 Кб); два денге вирусы, БР / 90 26 и NGC 29 (~ 11 кб); вирус бычьей вирусной диареи, SD1 (~ 12 кб); 25 двухместных классических вирусов чумы свиней, C и Падерборн (~ 12 кб), 24 вирус пограничной болезни, Gifhorn (~ 12 кб), 24 свиной вирус репродуктивного и респираторного синдрома , PL97-1 / LP1 (~ 15 кб); 30 передающийся вирус гастроэнтерита, PUR46-MAD (~ 29 кб), 16 кошачий вирус инфекционного перитонита,DF-2 (~ 29 кб); 32 тяжелого острого респираторного синдрома коронавирус, Урбани (~ 30 кб); 9 респираторный синдром коронавируса Ближний Восток, EMC / 2012 (~ 30 кб); 17 и человека коронавирус, OC43 (~ 31 Кб) 31 Основным преимуществом использования БАС для строительства кДНК высокой генетической стабильности крупных, 1- или 2-копии плазмид ВАС. Однако, внутренняя природа его количества чрезвычайно низкой копирования также большим недостатком, из-за очень низких выходов ДНК ВАС и последующим снижением чистоты ДНК ВАС, в отношении хромосомной ДНК хозяина. В текущем протоколе, выход ВАС-ДНК максимизируется путем выращивания E. палочка DH10B трансформировали инфекционного BAC PBAC / SA 14 -14-2 в питательной среде, 2xYT. Несмотря на это усилий, средняя урожайность составляет всего ~ 15 мкг ВАС-ДНК из 500 мл бульона 2xYT. Кроме того, чистота ВАС-ДНК лучше всего достигается с помощью CsCl-EtBr центрифугирования в градиенте плотности для очисткиВместо обычно используемого столбца на основе выделения плазмид. Тем не менее, важно иметь в виду, что ВАС-трансформированную E. палочка не должны зарастать, потому что это может поставить под угрозу генетической стабильности клонированной кДНК, и более высокие темпы роста не обязательно приведет к повышению урожайности или BAC ДНК выше чистоты. Протокол, описанный здесь, это оптимизированная, эффективный и рациональный способ построения и распространения генетически стабильной полнометражного инфекционное кДНК клона как BAC для JEV, процедура когда-то думали практически невозможно. Та же самая стратегия клонирования может быть применено ко многим другим положительным прядь РНК-вирусов. В целом, инфекционные кДНК-клоны позволяют ввести различные мутации (например, делеции, вставки, и точечные мутации) в вирусный геном РНК, чтобы изучить их биологические функции в репликации вируса и патогенеза. Это кДНК-система обратной генетики позволяет разрабатывать и ТЭСт вакцину и терапевтические кандидаты ориентирована на фактор (ы) вирулентности конкретного положительного нити РНК-вируса, представляющего интерес. Кроме того, эта технология инфекционное кДНК может быть также использован в качестве вирусного вектора, способного экспрессировать чужеродный ген (ы) интерес для многих приложений в биомедицинских исследований.

РНК вирусологи, появление технологии рекомбинантной ДНК в конце 1970-х годов стало возможным преобразовать вирусной РНК геномы в кДНК-клонов, которые затем могут быть размножены в плазмид в бактерии для генетической манипуляции РНК-содержащих вирусов. 1 Первый РНК-вирус, чтобы быть молекулярно клонировали был бактериофага Qβ, положительно нити РНК вируса, который заражает кишечной палочки. Плазмиду, содержащую полную копию кДНК геномной РНК Qβ привело к инфекционным фагов Qβ, когда вводят его в Е. палочка. 2 Вскоре после этого, этот метод был применен к полиовируса, положительно нити РНК вируса человека и животных. Плазмида несущий полноразмерной кДНК полиовируса геномной РНК инфекционное при трансфекции в клетки млекопитающих и способны производить инфекционных вирионов 3 В этом &quot;ДНК-запущен&quot; подход, клонированные кДНК следует транскрипции внутри клетки, чтобы инициировать репликацию вируса РНК.Однако неясно, насколько транскрипция инициируется и как транскрипты обработаны для правильной последовательности вирусной. Эта проблема привела к развитию альтернативы &quot;РНК-запущен&quot; подход, при котором полная копия кДНК вирусного генома РНК клонируют под промотором распознается Е. палочка или РНК-полимераза фага для производства синтетических РНК в пробирке с определенной 5 &#39;и 3&#39; концах, которые подвергаются полный цикл репликации вируса при введении в клетки-хозяева. 4,5 Первый успех с этим подходом было сообщено для костра вируса мозаики , 6,7-положительная нить РНК вируса растений. С тех пор, РНК-запущен подход был разработан для широкого круга положительной цепь РНК вирусов, в том числе, калицивирусов альфавирусов, флавивирусов, arteriviruses и коронавирусов. 1,4,5,8 В обоих ДНК- и РНК-запустила систем обратного генетики, строительство FULL-кДНК клона является ключом к генерации инфекционного ДНК или РНК из положительной нити РНК-содержащих вирусов, но становится значительным технической задачей, так как размер вирусных геномных увеличивается. 9-17 В частности, большое РНК генома ~ 10 -32 кб представлены три основные препятствия на пути клонирования полноразмерной кДНК функциональной. 18 Первая трудность является синтез верный кДНК копировать, так как верность RT-PCR обратно пропорциональна длине вирусной РНК. Второе препятствие является наличие потенциально токсичных последовательностей, так как длинные молекулы РНК, скорее всего, содержит неожиданные последовательности, способные сделать фрагмент кДНК в плазмидах нестабильных в E. палочка. Третий и наиболее важным вопросом является наличие подходящего вектора, поскольку трудно найти клонирования вектор, который может доме вирусной кДНК вставку&gt; 10 кб. За последние три десятилетия, эти барьеры были преодолены несколько достижений в энзимологии, методология, А.Н.д vectorology. 1,4,5,8 Из них наиболее перспективным и инновационное развитие является клонирование больших положительно цепь РНК вирусов, как инфекционных бактериальных хромосом (искусственные Бач). Вектор ВАС является низкой копию клонирование плазмиду (1-2 копий / клетку) на основе Е. палочка фактором фертильности, со средним размером вставки ДНК ~ 120-350 кб 19-21 Фрагмент ДНК встраивали в вектор BAC в аналогично клонирования в общих векторов клонирования. в результате ВАС клоны стабильно на протяжении многих поколений в E. палочка. 22,23 На сегодняшний день, технология ВАС были использованы для создания инфекционных клонов кДНК для&gt; 10 членов трех положительно нити РНК вируса семей, т.е. Flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 и Coronaviridae. 9,16,17 , 31,32 Использование японской энцефалита (Jev) в качестве примера, данная работа сообщает подробные процедуры, которые могут бытьиспользуется для построения стабильного генетически полнометражный инфекционного BAC для различных положительной нити РНК-вирусов. JEV является зоонозных флавивирус 33, который передается в природе между птицами, свиньями и другими позвоночных хозяев по комарами-переносчиками. 34,35 В людях, JEV инфекция может вызвать суровый часто роковую неврологические заболевания японский энцефалит (ЯЭ), 36 который происходит в Азия и части западной части Тихого океана, 37,38 по оценкам ежегодной заболеваемости ~ 50,000-175,000 клинических случаев. 39,40 В геноме JEV является ~ 11 т.п.н., одноцепочечной, положительным смысле молекулы РНК и состоит из один открытая рамка считывания (ORF), в окружении двух некодирующих областей (NCRs) на 5 &#39;и 3&#39; концы. 41,42 ОРС кодирует полипротеин, который расщепляется хостом и вирусных протеаз, чтобы генерировать 10 отдельных белков, обозначенный С PRM, Е, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5 в N- к С-концевой направлении. 34,43,44 Кроме того, электроннаяXtended форма NS1 (NS1 &quot;) выражается -1 рибосомальной frameshifting на кодонов 8-9 из NS2A. 45,46 Из этих 11 белков, три структурные белки (С, PRM и E) имеют важное значение для формирования инфекционного вирионы, 47,48 и остальные восемь неструктурные белки (NS1, чтобы NS5, и NS1 &quot;) имеют решающее значение для репликации вируса РНК, сборку 49-51 частиц, 52-56 и врожденной уклонения иммунитета. 57-59 Оба 5&#39;- и 3&#39; &quot;NCRs содержат сохраняется первичных последовательностей и форма РНК вторичных / третичных структур, 60-62, которые важны для модуляции вирусной репликации РНК. 63,64 Этот протокол описывает инструменты, методы и стратегии для создания полной длины инфекционное ВАС от JEV SA 14 -14-2. 28 Этот функциональный ВАС-клон содержит полную копию кДНК геномной РНК JEV, 65, который охватывается промоутер для SP6 РНК-полимеразы передвирусного 5&#39;-конце и уникальный Xba I сайта рестрикции вниз по течению от вирусной 3&#39;-конце для в пробирке стоки транскрипции. Эта технология ВАС применимо к построения полнофункциональной кДНК клона молекул для массива положительно нити РНК-вирусов.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Molecular Cloning&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2xYT Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2377</td><td></td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]UTP</td><td>PerkinElmer</td><td>NET380250UC</td><td>Radioactive</td></tr><tr><td>50 ml Tube</td><td>Thermo Scientific (Nalgene)</td><td>3114-0050</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Bottle</td><td>Beckman Coulter</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (Low Melting Point)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England BioLabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0553S</td><td></td></tr><tr><td>BsrGI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0575S</td><td></td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cesium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1595-1</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>Carcinogenic</td></tr><tr><td>DE-81 Filter Paper</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3658-023</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18427-088</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DH10B&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18297-010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td>Toxic and highly mutagenic</td></tr><tr><td>Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-26</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>Irritating</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>High-fidelity DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Isoamyl Alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9392</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>Isopropanol&amp;nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0918</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>Lithium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Amresco</td><td>0663</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Reverse Transcriptase</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>Mung Bean Nuclease</td><td>New England BioLabs</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>Needle (18G, 20G)</td><td>BD</td><td>305196, 305175</td><td>Biohazardous (Sharps waste)</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotide</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom Oligonucleotide Synthesis</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>pBeloBAC11</td><td>New England BioLabs</td><td>ER2420S (E4154S)</td><td></td></tr><tr><td>Phenol (Buffer-Saturated)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15513-039</td><td>Toxic and highly corrosive</td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15593-031</td><td>Toxic and highly corrosive</td></tr><tr><td>Phenol:Guanidine Isothiocyanate</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>10296-010</td><td>Toxic, corrosive, and irritating</td></tr><tr><td>Pme I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Acetate</td><td>Amresco</td><td>0698</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>rNTP Set</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>Sealable Polypropylene Tube (16 &amp;times; 76 mm)&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>342413</td><td></td></tr><tr><td>SfiI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0123S</td><td></td></tr><tr><td>Sma I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Amresco</td><td>0227</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0207S</td><td></td></tr><tr><td>Spin Column (Plasmid Miniprep Kit)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-11</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>HSW NORM-JECT</td><td>4200.000V0</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0826</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (yeast)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15401-011</td><td></td></tr><tr><td>XbaI&amp;nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. Cell Culture&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alpha Minimal Essential Medium</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>12561-049</td><td></td></tr><tr><td>Conical Tube (50 mL)</td><td>VWR</td><td>21008-242</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>Culture Dish (150 mm)&amp;nbsp;</td><td>TPP</td><td>93150&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette (2-mm Gap)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450125&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td>Toxic and carcinogenic</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>61100-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Six-Well Plate</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Vitamins</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose Gel Electrophoresis System</td><td>Mupid</td><td>MPDEXU-01</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heracell 150i</td><td></td></tr><tr><td>Desktop Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld)</td><td>UVP</td><td>UVGL-58</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>368826</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Life Technologies (Applied Biosystems)</td><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Scientific Industries</td><td>G-560</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Jeio Tech</td><td>WB-10E</td><td></td></tr></tbody></table>

bacterial artificial chromosomes: a functional genomics tool for the study of positive-strand rna viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses at JoVE.com

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Бактериальный искусственные хромосомы: Функциональный геномики инструмент для изучения Положительный нити РНК вирусы

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

bacterial-artificial-chromosomes-functional-genomics-tool-for-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.3K Views.  Utah State University. Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Video: Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal phase during establishment of infection in a given host. Consequently, study of encapsidation deciphers the information regarding the know-how of the mechanism regulating virus assembly to form infectious virions. Such information is vital in formulating novel methods of curbing virus spread and disease control. Virus encapsidation can be studied in vivo and in vitro. Genome encapsidation in vivo is a highly regulated selective process involving macromolecular interactions and subcellular compartmentalization. Therefore, study leading to dissect events encompassing virus encapsidation in vivo would provide basic knowledge to understand how viruses proliferate and assemble. Recently in vitro encapsidation has been exploited for the research in the area of biomedical imaging and therapeutic applications. Non-enveloped plant viruses stand far ahead in the venture of in vitro encapsidation of the negatively charged foreign material. Brome mosaic virus (BMV), a non-enveloped multicomponent RNA virus pathogenic to plants, has been used as a model system for studying genome packaging in vivo and in vitro. For encapsidation assays in Nicotiana benthamiana plants, Agrobacterium -mediated transient expression, refer to as agroinfiltration, is an efficient and robust technique for the synchronized delivery and expression of multiple components to the same cell. In this approach, a suspension of Agrobacterium tumefaciens cells carrying binary plasmid vectors carrying cDNAs of desiredviral mRNAs is infiltrated into the intercellular space withina leaf using nothing more sophisticated than a 1 ml disposable syringe (without needle). This process results in the transfer of DNA insert into plant cells; the T-DNA insert remains transiently in the nucleus and is then transcribed by the host polymerase II, leading to the transient expression. The resulting mRNA transcript (capped and polyadenylated) is then exported to the cytoplasm for translation. After approximately 24 to 48 hours of incubation,sections of infiltrated leaves can be sampled for microscopyor biochemical analyses. Agroinfiltration permits large numbers (hundreds to thousands) of cells to be transfected simultaneously. For in vitro encapsidation, purified virions of BMV are dissociated into capsid protein by dialyzing against dissociation buffer containing calcium chloride followed by removal of RNA and un-dissociated virions by centrifugation. Genome depleted capsid protein subunits are then reassembled with desired viral genome components or non-viral components such as indocyanine dye.

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

A simple, efficient and robust way to synchronize the delivery of multiple viral components to plant cells via Agrobacterium-mediated transient expression is described. This approach is amenable for studying replication, encapsidation followed by in vitro reassembly of non-viral components into genome depleted optical viral ghosts suitable for biomedical applications.

Простая и надежная В естественных условиях И В пробирке Подход к изучению вируса Ассамблеи

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

Высокопроизводительный скрининг для широкого спектра химических ингибиторов РНК-содержащих вирусов

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Reverse Genetics to Engineer Positive-Sense RNA Virus Variants

The lack of a convenient method for the iterative generation of diverse full-length viral variants has impeded the study of directed evolution in RNA viruses. By integrating a full RNA genome error-prone PCR and reverse genetics, random genome-wide substitution mutagenesis can be induced. We have developed a method using this technique to synthesize diverse libraries to identify viral mutants with phenotypes of interest. This method, called full-length mutant RNA synthesis (FL-MRS), offers the following advantages: (i) the ability to create a large library via a highly efficient one-step error-prone PCR; (ii) the ability to create groups of libraries with varying levels of genetic diversity by manipulating the fidelity of DNA polymerase; (iii) the creation of a full-length PCR product that can directly serve as a template for mutant RNA synthesis; and (iv) the ability to create RNA that can be delivered into host cells as a non-selected input pool to screen for viral mutants of the desired phenotype. We have found, using a reverse genetics approach, that FL-MRS is a reliable tool to study viral-directed evolution at all stages in the life cycle of the hepatitis C virus, JFH1 isolate. This technique appears to be an invaluable tool to employ directed evolution to understand adaptation, replication, and the role of viral genes in pathogenesis and antiviral resistance in positive-sense RNA viruses.

The protocol describes a method for introducing controllable genetic diversity in the hepatitis C virus genome by combining full-length mutant RNA synthesis using error-prone PCR and reverse genetics. The method provides a model for phenotype selection and can be used for 10 kb long positive-sense RNA virus genomes.

Реверсивная генетика для создания вариантов РНК-вируса с положительным смыслом

The lack of a convenient method for the iterative generation of diverse full-length viral variants has impeded the study of directed evolution in RNA ...

Genetics

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and assay development in virology. The RNA template of nonsegmented negative-sense (NNS) RNA viruses, such as the respiratory syncytial virus (RSV), is not an RNA molecule alone but rather a nucleoprotein (N) encapsidated ribonucleoprotein complex. Despite the importance of the authentic RNA template, the generation and assembly of such a ribonucleoprotein complex remain sophisticated and require in-depth elucidation. The main challenge is that the overexpressed RSV N binds non-specifically to cellular RNAs to form random nucleocapsid-like particles (NCLPs). Here, we established a protocol to obtain RNA-free N (N0) first by co-expressing N with a chaperone phosphoprotein (P), then assembling N0 with RNA oligos with the RSV-specific RNA sequence to obtain virus-specific nucleocapsids (NCs). This protocol shows how to overcome the difficulty in the preparation of this traditionally challenging viral ribonucleoprotein complex.

For in-depth mechanistic analysis of the respiratory syncytial virus (RSV) RNA synthesis, we report a protocol of utilizing the chaperone phosphoprotein (P) for coexpression of the RNA-free nucleoprotein (N0) for subsequent in vitro assembly of the virus-specific nucleocapsids (NCs).

Генерация и сборка вирус-специфических нуклеокапсидов респираторно-синцитиального вируса

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

Biochemistry

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or specific treatments for the disease caused by these viruses, and work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories, significantly limiting the research on these viruses. Lifecycle modeling systems model the virus lifecycle under biosafety level 2 conditions; however, until recently such systems have been limited to either individual aspects of the virus lifecycle, or a single infectious cycle. Tetracistronic minigenomes, which consist of Ebola virus non-coding regions, a reporter gene, and three Ebola virus genes involved in morphogenesis, budding, and entry (VP40, GP1,2, and VP24), can be used to produce replication and transcription-competent virus-like particles (trVLPs) containing these minigenomes. These trVLPs can continuously infect cells expressing the Ebola virus proteins responsible for genome replication and transcription, allowing us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions. Importantly, the viral components of this systems are solely derived from Ebola virus and not from other viruses (as is, for example, the case in systems using pseudotyped viruses), and VP40, GP1,2 and VP24 are not overexpressed in this system, making it ideally suited for studying morphogenesis, budding and entry, although other aspects of the virus lifecycle such as genome replication and transcription can also be modeled with this system. Therefore, the tetracistronic trVLP assay represents the most comprehensive lifecycle modeling system available for Ebola viruses, and has tremendous potential for use in investigating the biology of Ebola viruses in future. Here, we provide detailed information on the use of this system, as well as on expected results.

Work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories. Tetracistronic minigenome-containing replication and transcription-competent virus like particles (trVLPs) represent a lifecycle modeling system that allows us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions, relying exclusively on Ebola virus components.

Моделирование жизненного цикла Эбола Вирус Меньше уровень биологической безопасности 2 Условия вирусом типа частиц, содержащих Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low titers in their host or cannot be mechanically inoculated to another host are difficult to propagate to achieve a greater titer of infectious material. Infected leaves are ground in a mild buffer with optimal pH and ionic composition recommended for purifying most bacilliform Para retroviruses. Urea is used to break up inclusion bodies that trap virions and to dissolve cellular components. Differential centrifugation provides further separation of virions from plant contaminants. Then proteinase K treatment removes the capsids. Then the viral DNA is concentrated and used for next-generation sequencing (NGS). The NGS data are used to assemble contigs which are submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in the generated dataset. In a parallel pipeline, RNA is isolated from infected leaves using a standard column-based RNA extraction method. Then ribosome depletion is carried out to enrich for a subset of mRNA and virus transcripts. Assembled sequences derived from RNA sequencing (RNA-seq) were submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in this dataset. In our study, we identified two related full-length badnavirus genomes in the two datasets. This method is preferred to another common approach which extracts the aggregate population of small RNA sequences to reconstitute plant virus genomic sequences. This latter metagenomic pipeline recovers virus related sequences that are retro-transcribing elements inserted into the plant genome. This is coupled to biochemical or molecular assays to further discern the actively infectious agents. The approach documented in this study, recovers sequences representative of replicating viruses that likely indicate active virus infection.

Here we present a new approach to identify plant viruses with double-strand DNA genomes. We use standard methods to extract DNA and RNA from infected leaves and carry out next-generation sequencing. Bioinformatic tools assemble sequences into contigs, identify contigs representing virus genomes and assign genomes to taxonomic groups.

Объединяя анализ ДНК в добыче сырой вириона с анализом РНК от зараженных листьев, чтобы обнаружить новый вирус геномов

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Арбовирусных инфекций как скрининг инструменты для выявления вирусной иммуномодуляторов и принимающих противовирусное факторов

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

Конфокальная томография двуцепочечной РНК и шаблон признание рецепторов в отрицательной смысл РНК вируса

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, both to decipher viral replication mechanisms and to study antivirals or provide development platform for vaccines. The construction and manipulation of a reverse genetic system for a negative-strand RNA virus such as a respiratory syncytial virus (RSV), however, remains delicate and requires special know-how. The RSV genome is a single-strand, negative-sense RNA of about 15 kb that serves as a template for both viral RNA replication and transcription. Our reverse genetics system uses a cDNA copy of the human RSV long strain genome (HRSV). This cDNA, as well as cDNAs encoding viral proteins of the polymerase complex (L, P, N, and M2-1), are placed in individual expression vectors under T7 polymerase control sequences. The transfection of these elements in BSR-T7/5 cells, which stably express T7 polymerase, allows the cytoplasmic replication and transcription of the recombinant RSV, giving rise to genetically modified virions. A new RSV, which is present at the cell surface and in the culture supernatant of BSRT7/5, is gathered to infect human HEp-2 cells for viral amplification. Two or three rounds of amplification are needed to obtain viral stocks containing 1 x 106 to 1 x 107 plaque-forming units (PFU)/mL. Methods for the optimal harvesting, freezing, and titration of viral stocks are described here in detail. We illustrate the protocol presented here by creating two recombinant viruses respectively expressing free green fluorescent protein (GFP) (RSV-GFP) or viral M2-1 fused to GFP (RSV-M2-1-GFP). We show how to use RSV-GFP to quantify RSV replication and the RSV-M2-1-GFP to visualize viral structures, as well as viral protein dynamics in live cells, by using video microscopy techniques.

We describe a method for generating and amplifying genetically modified respiratory syncytial viruses (RSVs) and an optimized plaque assay for RSVs. We illustrate this protocol by creating two recombinant viruses that respectively allow quantification of RSV replication and live analysis of RSV inclusion bodies and inclusion bodies-associated granules dynamics.

Поколение, усилители и титрование рекомбинантных респираторных вирусов-синцитиальный

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines and/or antivirals have underscored the urgent need to develop ZIKV reverse genetic systems to facilitate the study of ZIKV biology and the development of therapeutic and/or prophylactic approaches. However, like with other flaviviruses, the generation of ZIKV full-length infectious cDNA clones has been hampered due to the toxicity of viral sequences during its amplification in bacteria. To overcome this problem, we have developed a nontraditional approach based on the use of bacterial artificial chromosomes (BACs). Using this approach, the full-length cDNA copy of the ZIKV strain Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) is generated from four synthetic DNA fragments and assembled into the single-copy pBeloBAC11 plasmid under the control of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter. The assembled BAC cDNA clone is stable during propagation in bacteria, and infectious recombinant (r)ZIKV is recovered in Vero cells after transfection of the BAC cDNA clone. The protocol described here provides a powerful technique for the generation of infectious clones of flaviviruses, including ZIKV, and other positive-strand RNA viruses, particularly those with large genomes that have stability problems during bacterial&#160;propagation.

The recent epidemic of Zika virus highlights the importance of establishing reverse genetic approaches to develop vaccines and/or therapeutic strategies. Here, we describe the protocol to rescue an infectious recombinant Zika virus from a full-length cDNA clone assembled in a bacterial artificial chromosome under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter.

Спасение рекомбинантного вируса Зика от бактериальной искусственной хромосомы клона

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

Бактериальный искусственные хромосомы: Функциональный геномики инструмент для изучения Положительный нити РНК вирусы

Резюме

Смотреть дополнительные видео

PLAYLIST