Финансирование этой работы была предоставлена ​​Fondation Бетанкур Schueller в поддержку команды Paris Бетанкур IGEM. Мы благодарим INSERM U1001 исследовательское подразделение и Шанталь Lotton для технической помощи и консультаций. Фагмидных Litmus28i_J23115-B0032-GFP была предоставлена ​​Моника Ortiz и Дрю Endy Стэнфорда.

1. Проектирование и строительство фагмидных векторов подшипника Срна Глушащий Кассеты <ol><li> De Novo Дизайн Срна Глушащий Кассеты 8 <ol><li> Определить полную последовательность мРНК, чтобы быть отключен с использованием базы данных последовательностей ДНК. Для генерирования последовательности - мишени, обратите внимание , первые 24 п.н. кодирующей последовательности, с позиции +1 до +24 начиная со стартового кодона (например, ATG). Примечание: шумопоглотительные менее эффективен , когда другие сайты или сегменты мРНК ориентированы 8. </li><li> Возьмите обратный комплемент последовательности TARGET для получения последовательности путеводителем на кассете Срна. В Таблице 1 приведены примеры TARGET и руководство по выбору последовательностей для хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT). </li><li> Для разработки 292 н.п. полное выражение рРНК кассету, организовать рк промотор, последовательность, GUIDE Hfq белка - связывающий домен и T1 / TE последовательности терминации транскрипции в серии (таблица 2). </li><li> Добавьте дополнительные сайты клонирования выбора для облегчения клонирования кассеты Срна в целевой вектор. </li><li> Получить полный Срна кассету посредством коммерческого синтеза генов или подобным способом и клонировать его в любой вектор фагмидного с начала репликации функционал f1 11. См вспомогательной информации для полной последовательности итогового вектора фагмидного. </li></ol></li><li> Изменение последовательности Целенаправленные существующим рРНК Expression Cassette с помощью ПЦР на основе сайт - направленного мутагенеза 12 <ol><li> Определите последовательность GUIDE 24 пар оснований в существующем экспрессии рРНК кассете. Примечание: аннотированный pAB.001 плазмиду, используемый в данной работе, доступен в качестве дополнительного файла последовательности. </li><li> Конструкция прямого и обратного праймеров с короткими областей гомологии к существующему Срна кассетой флангового новый 24 п.н. последовательность GUIDE. Получение праймеров посредством коммерческого синтеза олигонуклеотидов. Примечание: Праймер дизайн для сайт-направленного мутагенеза depicTed на рисунке 2. Последовательности праймеров шаблон Целую представлены в таблице 3. </li><li> Приготовьте 5 мл культуры E. палочка проведения экспрессии рРНК шаблон фагмиду. Grow клеток в течение ночи при 37 ° C при встряхивании в LB среде с соответствующими антибиотиками. </li><li> Извлечение и очистить выражение фагмиду шаблон Срна из 5 мл бактериальной культуры с использованием набора ДНК минипрепаративную или подобный метод 12. </li><li> Приготовьте две реакции ПЦР с использованием экспрессии рРНК шаблон фагмиду и высокую точность полимеразу, один с вперед и один с обратным праймером (таблица 4). Использование условий ПЦР в соответствии с рекомендациями поставщика полимеразы (таблица 5). Увеличение концентрации матрицы для 10-50x выше стандартной реакции, чтобы учесть тот факт, что реакция одиночный праймер не производит экспоненциальное усиление. </li><li> Объедините две вышеуказанные реакции ПЦР в микроцентрифужных трубки. Anneaл продукты путем нагревания до 98 ° С в водяной бане. Сразу после размещения микроцентрифужных трубки в ванну с водой, удалить источник тепла и экономичность ванны медленно нагреться до комнатной температуры в течение 1-2 ч. </li><li> Для устранения немутированного шаблон Срна выражение фагмиду, добавить 1 мкл. DpnI ограничительного фермента к смеси, и инкубировали при 37 ° С в течение 1 ч, или время, рекомендованным производителем для полного переваривания. Примечание: DpnI переваривает только метилированных целевые сайты, которые присутствуют на хост-репликации фагмид, но не продукты ПЦР. </li><li> Transform приобрели или подготовленные 13 химически компетентную E. палочка 1-5 мкл отожженного продукта ПЦР. Изолировать отдельных колоний трансформированного штамма с помощью селективного посева на чашках с LB, содержащих соответствующие антибиотики. </li><li> Для проверки включения правильной последовательности GUIDE, экран полученных колоний ПЦР колоний. Использование 200 мкл пипетки, соllect небольшое количество клеток из одной трансформированной колонии. Марк и сохранить первоначальную колонию для дальнейшего использования после проверки. </li><li> Добавьте собранные клетки в 50 мкл нуклеазы без воды в микроцентрифужных трубки. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз. </li><li> Использование стендовом Термоциклер или бане с кипящей водой, лизиса клеток при нагревании до 95 ° С в течение 2 мин. </li><li> ПЦР-амплификации с использованием Фагмидную область 1 мкл термически лизису клеток в качестве ДНК-матрицы. Условия ПЦР и протоколы Термоциклеры представлены в таблицах 6 и 7. Смотрите дополнительный файл последовательности pAB.001 для последовательностей проверки праймеров. </li><li> Последовательность ПЦР-продукта для проверки включения правильной последовательности GUIDE. </li><li> Инокуляции 5 мл культуры Е. палочка клон , несущий последовательность , подтвержденные экспрессии рРНК фагмиду. Grow клеток в течение ночи при 37 ° C при встряхивании, в селективной среде LB. </li><li> Подготовить глицеринеклона-последовательности проверена. Добавьте 750 мкл ночной культуры в 250 мкл 60% глицерина в крио трубки с завинчивающейся крышкой. </li><li> Храните глицерине при -80 ° С до бесконечности. Остальная часть ночной культуры, могут быть использованы в качестве источника для экспрессии фагемид Срна на шаге 2. </li></ol></li></ol> 2. Производство и Урожай М13 упакованных запасов фагмидных <ol><li> Приготовьте 5 мл культуры E. палочка проведения экспрессии фагмиду Срна. Grow клеток в течение ночи при 37 ° C при встряхивании в LB среде с соответствующими антибиотиками. Примечание: Выражение Фагмидную рРНК , может быть получен путем клонирования De Novo , как описано в шаге 1.1.5, или модифицированный из существующего фагемид и собирают на этапе 1.2.16. </li><li> Аналогичным образом готовят 5 мл культуры E. палочка проведения вспомогательной плазмиды M13KO7. Grow клеток в течение ночи при 37 ° C при встряхивании, в селективной среде LB. </li><li> Извлечение и очистить expressio Срнап Фагмидную и помощник плазмида с использованием набора для экстракции ДНК или другим подобным способом 12. </li><li> Cotransform приобрели или подготовленные 13 химически компетентные клетки Е.coli с 1 мкл каждого из выражения фагемид Срна и плазмиды - хелпера. Выберите для cotransformants при посеве на LB агар с селективными антибиотиками для обеих конструкций. </li><li> Приготовьте 10 мл культуры из одной колонии штамма котрансформировали в LB с селективными антибиотиками. Инкубируют при 37 ° C при встряхивании в течение 8-12 ч или в течение ночи. </li><li> Центрифуга культуру при 3,300 мкг в течение 10 мин. Собирают супернатант и фильтруют через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Внимание: В случае разлива СМИ, очистить область с разбавленной хлорной извести (0,5%), чтобы уничтожить инфекционный фаговых частиц. </li><li> Храните упакованную Фагмидную фильтрату при температуре 4 ° С. Примечание: Образцы могут быть сохранены в течение нескольких дней до нескольких недель без потери активности. </li></ol> 3. Получение F + клеток - мишеней для Глушащий <ol><li> Определите , могут ли клетки быть направлены для глушителей выразить F пилей 14. Если F пилуса уже присутствует, перейдите к шагу 4. Примечание: обычные лабораторные штаммы E. палочка аннотируются , как F + или F &#39; , чтобы указать присутствие пилуса F в своем геноме или на плазмиде. </li><li> Получить штамм F + из E. палочки , такие как ТОР10F &#39;. Примечание: Убедитесь в том, что целевой штамм несет уникальный маркер устойчивости для того, чтобы отделить от F-плазмиды донора после конъюгации. </li><li> Для того, чтобы ввести F пилей сопряжением с штамма F +, готовить 5 мл культуры как целевого штамма и F-плазмиды донора 14. Grow клеток в течение ночи при 37 ° C при встряхивании в LB среде с соответствующими антибиотиками. </li><li> На следующий день, развести оба штамма 1: 100 в 5 мл селективной LB и продолжают культивирование при 37 ° C при встряхивании. </li><li> Определить фазу роста клеток путем измерения неавтоматическогоскую плотность культуры при 600 нм (OD 600) с использованием стендовых спектрофотометра. Культуры клеток в течение приблизительно 2 ч , пока OD 600 0,3 достигается, что указывает на рост 15 лог-фазы. </li><li> Приготовьте 3 реакций конъюгации в микропробирок: 0,5 мл F-плазмида донор + 0,5 мл целевого штамма, 0,5 мл F-плазмида донор + 0,5 мл LB СМИ (отрицательный контроль) и 0,5 мл целевого штамма + 0,5 мл LB СМИ (отрицательный контроль). Разрешить конъюгация протекать в течение 2 ч при 37 ° C при встряхивании. </li><li> Пластина 100 мкл каждой реакции конъюгации на селективном LB агар с антибиотиками, специфичными для F-плазмиды (как правило, тетрациклин) и целевой штамм. Пластина негативные реакции контроля, чтобы подтвердить, что ни один донор или штамм получатель выражают как антибиотик сопротивления. </li></ol> 4. Заражение Packaged Фагмиды для Глушащий <ol><li> Инокулируйте одну колонию клеток F + цель в 5 мл культуры LB MediА с соответствующими антибиотиками. Инкубируют в течение ночи при 37 ° C при встряхивании. </li><li> На следующий день, разбавленные клетки - мишени 1 М +: 100 в 5 мл селективной среды LB и продолжают культуры при 37 ° C при встряхивании. </li><li> Определяют фазу роста клеток путем измерения оптической плотности культуры при 600 нм (OD 600) с использованием стендовых спектрофотометра. Культуры клеток в течение приблизительно 2 ч , пока OD 600 0,3 достигается, что указывает на рост 15 лог-фазы. Примечание: Экспрессия пилей и инфекции эффективность F является самой высокой в ​​лог-фазе. </li><li> Добавьте М13-упакованные фагемиды (со стадии 2.6) в клетки-мишени в объемном соотношении от 1: 100 до достижения почти 99% инфицирование целевой группы населения. Позволить инфекции протекать при 37 ° С при встряхивании в течение 30-60 мин. </li><li> Анализ на рРНК-заглушающие фенотип в соответствии с методом выбора. Примечание: Для получения флуоресцентного белка-мишени, эффект глушителей может быть определена количественнонепосредственно флуориметрии 10. С другой стороны , фенотипические анализы могут быть использованы для наблюдения за фенотипические последствия гена бросовой 8. </li><li> Подготовка глицерина запас для рРНК-выражающей фагмидного хоста следующие шаги 1.2.14-1.2.16. Примечание: Фагмидную будет распространяться в штамме-хоз ине на неопределенный срок и может поддерживаться с антибиотиками подобно обычной плазмиды. </li></ol>

<ol>
	<li>Ohkumo, T., Masutani, C., Eki, T., Hanaoka, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RNAi+in+C.+elegans.">Use of RNAi in C. elegans.</a> RNAi. , 129-137 (2008).</li><li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+interference+by+dsRNA+injection+into+Drosophila+embryos.">RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos.</a> J Vis Exp. (50), e2477 (2011).</li><li>Ramadan, N., Flockhart, I., Booker, M., Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+implementation+of+high-throughput+RNAi+screens+in+cultured+Drosophila+cells.">Design and implementation of high-throughput RNAi screens in cultured Drosophila cells.</a> Nat Protoc. 2 (9), 2245-2264 (2007).</li><li>Tsong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cell+membranes.">Electroporation of cell membranes.</a> Biophys J. 60 (2), 297-306 (1991).</li><li>Kim, W. J., Chang, C. -. W., Lee, M., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+siRNA+delivery+using+water+soluble+lipopolymer+for+anti-angiogenic+gene+therapy.">Efficient siRNA delivery using water soluble lipopolymer for anti-angiogenic gene therapy.</a> J Control Release. 118 (3), 357-363 (2007).</li><li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+RNAi+for+the+masses.">Mammalian RNAi for the masses.</a> Trends Genet. 19 (1), 9-12 (2003).</li><li>Na, D., Yoo, S. M., Chung, H., Park, H., Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+Escherichia+coli+using+synthetic+small+regulatory+RNAs.">Metabolic engineering of Escherichia coli using synthetic small regulatory RNAs.</a> Nat Biotechnol. 31 (2), 170-174 (2013).</li><li>Ceroni, F., Algar, R., Stan, G. -. B., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cellular+capacity+identifies+gene+expression+designs+with+reduced+burden.">Quantifying cellular capacity identifies gene expression designs with reduced burden.</a> Nat Methods. 12 (5), 415-418 (2015).</li><li>Libis, V. K., Bernheim, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+Antibiotic+Resistance+in+E.+coli+with+Engineered+Phage+Bearing+Small+Regulatory+RNAs.">Silencing of Antibiotic Resistance in E. coli with Engineered Phage Bearing Small Regulatory RNAs.</a> ACS Synth Biol. 3 (12), 1003-1006 (2014).</li><li>Ortiz, M. E., Endy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+cell-cell+communication+via+DNA+messaging.">Engineered cell-cell communication via DNA messaging.</a> J Biol Eng. 6 (1), 16 (2012).</li><li>Edelheit, O., Hanukoglu, A., Hanukoglu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+site-directed+mutagenesis+using+two+single-primer+reactions+in+parallel+to+generate+mutants+for+protein+structure-function+studies.">Simple and efficient site-directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies.</a> BMC Biotechnol. 9 (1), 61 (2009).</li><li>Chung, C. T., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+storage+of+competent+Escherichia+coli+cells.">Preparation and storage of competent Escherichia coli cells.</a> Recombinant DNA Part I. , 621-627 (1993).</li><li>Phornphisutthimas, S., Thamchaipenet, A., Panijpan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+in+Escherichia+coli.">Conjugation in Escherichia coli.</a> Biochem Mol Biol Educ. 35 (6), 440-445 (2007).</li><li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+Physiology+in+Luria-Bertani+Broth.">Escherichia coli Physiology in Luria-Bertani Broth.</a> J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li><li>Mittal, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+efficiency+of+RNA+interference+in+mammals.">Improving the efficiency of RNA interference in mammals.</a> Nat Rev Genet. 5 (5), 355-365 (2004).</li><li>Qi, L. S., Larson, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression.">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).</li><li>Lu, T. K., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersing+biofilms+with+engineered+enzymatic+bacteriophage.">Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (27), 11197-11202 (2007).</li><li>Yosef, I., Manor, M., Kiro, R., Qimron, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperate+and+lytic+bacteriophages+programmed+to+sensitize+and+kill+antibiotic-resistant+bacteria.">Temperate and lytic bacteriophages programmed to sensitize and kill antibiotic-resistant bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (23), 7267-7272 (2015).</li><li>Karlsson, F., Malmborg-Hager, A. -. C., Albrekt, A. -. S., Borrebaeck, C. A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+comparison+of+phage+M13-infected+vs.+uninfected+Escherichia+coli.">Genome-wide comparison of phage M13-infected vs. uninfected Escherichia coli.</a> Can J Microbiol. 51 (1), 29-35 (2005).</li><li>Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveat+of+RNAi+in+plants:+the+off-target+effect.">Caveat of RNAi in plants: the off-target effect.</a> Methods in molecular biology. 744, 13-25 (2011).</li><li>Jackson, A. L., Linsley, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognizing+and+avoiding+siRNA+off-target+effects+for+target+identification+and+therapeutic+application.">Recognizing and avoiding siRNA off-target effects for target identification and therapeutic application.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (1), 57-67 (2010).</li><li>Cho, S. W., Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+off-target+effects+of+CRISPR/Cas-derived+RNA-guided+endonucleases+and+nickases.">Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases.</a> Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).</li><li>Hagens, S., Blasi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+filamentous+phage+as+bactericidal+agents:+a+pilot+study.">Genetically modified filamentous phage as bactericidal agents: a pilot study.</a> Lett Appl Microbiol. 37 (4), 318-323 (2003).</li><li>Kasman, L. M., Kasman, A., Westwater, C., Dolan, J., Schmidt, M. G., Norris, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+phage+replication+threshold:+a+mathematical+model+with+implications+for+phage+therapy.">Overcoming the phage replication threshold: a mathematical model with implications for phage therapy.</a> J Virol. 76 (11), 5557-5564 (2002).</li><li>Chasteen, L., Ayriss, J., Pavlik, P., Bradbury, A. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eliminating+helper+phage+from+phage+display.">Eliminating helper phage from phage display.</a> Nucleic Acids Res. 34 (21), e145 (2006).</li><li>Lu, T. K., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+bacteriophage+targeting+gene+networks+as+adjuvants+for+antibiotic+therapy.">Engineered bacteriophage targeting gene networks as adjuvants for antibiotic therapy.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (12), 4629-4634 (2009).</li><li>Bikard, D., Jiang, W., Samai, P., Hochschild, A., Zhang, F., Marraffini, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+repression+and+activation+of+bacterial+gene+expression+using+an+engineered+CRISPR-Cas+system.">Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system.</a> Nucleic Acids Res. 41 (15), 7429-7437 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Данный способ достичь 80 снижение уровня флуоресценции mKate% по сравнению с нецелевым управления. Это согласуется с другими методами нокдаун РНК, где полное глушение не наблюдается и эффективность 50-90% является типичным 16,17. На фенотипической уровне, CAT-целевой нокдаунов были способны значительно ослабить устойчивость к хлорамфениколу, и устранить ее при определенных условиях. Нокдаун фенотип был обнаружен на уровне населения после того, как всего за несколько часов после инфицирования (рис 3B). Это иллюстрирует важную особенность фага на основе доставки: высокая нокдаун частота может быть получена непосредственно в периодической культуре без предварительного генетической модификации. В отличие от обычных генетических модификаций с использованием трансформации плазмидами или геномную интеграцию, фаговой инфекции не требует, чтобы популяция быть повторно выращены из одной изолированной колонии. Это позволяет эффекты фаговой инфекции быть Explorе изд в популяциях со сложной пространственной динамики 11, с ранее существовавших пространственных структур , как биопленки 18, или в генетически смешанных природных популяций 19. Важным шагом в этом методе является производство фасованного фагемид на высоком титре. Метаболический бремя, связанное с производством фага частиц может привести к высокому уровню мутации или потери плазмиды в фагмидного производства штамма. Рекомендуется, чтобы Фагмидную производство штамма культивировать непосредственно из одной колонии котрансформировали и не охлажденный, замороженный или субкультивироваться до урожая фага. Низкая эффективность совместного преобразования также может наблюдаться при введении фагмидных и вспомогательной плазмиды Е. палочки одновременно. В этом случае более высокую эффективность, могут быть получены путем трансформации вспомогательной плазмиды, а затем готовит компетентных клеток, несущих плазмиду хелпер для последующей трансформации с фагмиды. Пхаgemid инфекция или выражение рРНК также налагает выявляемой метаболический нагрузку на клетки-мишени, и может привести к некоторому фенотипической возмущения. Например, наблюдалось снижение mKate2 флуоресценции даже тогда , когда клетки были инфицированы фагмидного нацеливание CAT (рисунок 3). Заражение M13 не думал , чтобы вызвать системные ответные реакции на стресс в E. палочка 20, но может изменить транскрипционные паттерны косвенно. С другой стороны , маркеры или GFP устойчивости к ампициллину , включенные в фагмиды могут конкурировать за клеточных ресурсов, снижение экспрессии mKate2 и роста 9. Наконец, сама рРНК кассета может глобально изменить профили экспрессии генов титрованием белок Hfq, либо через офф-мРНК-мишени глушителей. Off целевые эффекты являются общими в в естественных условиях RNAi ориентации 21-23, но они до сих пор систематически исследованы для этой системы. Одним из ограничений этого метода является то, что инфекция энергосбетивность составляет менее 100%, что позволило в некоторых неинфицированные бактерии сохраняться в популяции. Результаты этой работы и более ранней работе 10 показывают , что неинфицированные клетки представляют собой 1-10% от конечного населения, и несут ответственность за большинство nonsilenced фенотипов наблюдается. Разнообразие маршрутов к М13-сопротивления , как известно, с наиболее распространенными из которых являются мутационный потере экспрессии 24 пилей. В свете этих ограничений, контроль должен быть использован для подтверждения высоких показателей заболеваемости и эффективности нокдаун. Другим потенциальным ограничением для некоторых приложений является случайный перенос загрязняющего фаг-хелпер. Хотя М13К07 содержит мутированный сигнал упаковки, она может быть упакована в фаг капсида при низкой частоте и переносится к зараженным популяции, в результате чего в клетках компетентных для фага производства и непрерывное распространение фага за пределы первоначального случае инфицирования 25. Модификации хелперного фага доказали свою эффективностьна снижение неспецифической упаковки, хотя иногда на себестоимость продукции пониженной фага 26. Engineered бактериофага стали незаменимым инструментом для E. палочка синтетической биологии, что позволяет быструю доставку новых генов для растущего населения. Последние работы производятся межклеточные цепи 11 связи или выражены факторы транскрипции для подавления резистентности к антибиотикам 27 дорожками. Протокол, представленные здесь, добавляет к растущей коллекции инструментов, которые позволяют контролировать бактериальной физиологии через запрограммированные РНК. CRISPR-Cas нуклеазы, когда мутируют для устранения нуклеазы активности, было показано , что репрессировать транскрипцию РНК в наведением мишеней генов 17,28. В противоположность этому, рРНК глушителей работает на уровне поступательным и не требует экзогенных экспрессии белка. биотехнологии следующего поколения могут объединяться транскрипции и трансляции контроль фагом-опосредованной доставки программного комплекса Phenoтипы в режиме реального времени.

РНК-опосредованных генов нокдаунов проходить в два этапа. Во-первых, молекула РНК вводят в линию или организма исследования клеток. Во-вторых, эндогенные РНК-связывающие белки облегчают распознавание РНК-мишени и производят эффект глушения. Все РНК нокдаун технологии выгоду от настраиваемой природы синтетических sRNAs, которые могут быть легко получены в соответствии конкретной цели интереса. Однако молекулярные детали поглощения РНК и глушителей широко варьироваться в зависимости от модели системы, сдерживая где и как РНК нокдаун могут быть применены. У нематод, двухцепочечной РНК (дцРНК) молекулы могут быть введены непосредственно в средствах массовой информации или путем кормления червей с населением дцРНК-экспрессирующие E. палочка клеток в 1,2 раза . У Drosophila, РНК - интерференция может быть достигнуто за счет microinjecting эмбрионов с дцРНК 3, или реализованы в клеточных линиях, просто добавляя дсРНК к культуральной среде 4. В клеточных линий млекопитающих,синтетические малые интерферирующие РНК (киРНК) , могут быть доставлены в живые клетки с помощью электропорации 1,2,5, упаковывают в липосомах 3,6, или экспрессированы из плазмидных ДНК - векторов 4,7. После того, как вид РНК достигает цитозоле, путь RNAi, опирается на комплекс RISC для обработки дцРНК, облегчить антисмысловую распознавание цели, и катализировать поступательную репрессии, деградацию мРНК, или формировании гетерохроматина, в зависимости от хоста. Из-за этих требований, классическая RNAi может быть выполнена только в организмах, которые занимают экзогенной РНК эффективно и выражающих RISC или RISC-подобную активность. Примечательно, что это исключает модель бактерии E. палочка, которая испытывает недостаток в пути RNAi. Тем не менее, последние достижения в области синтетической биологии предоставляют инструменты для решения как проблемы доставки и проблему глушения. В этом протоколе Srna конструкции экспрессируется в E. палочка из вектора ДНК доставляется LiВинг клетки с помощью Фагмидную / помощника системы M13. Фагмидную является любая плазмида с фаговой происхождения f1 начала репликации. Помощник плазмида, в этом случае M13KO, несет все оборудование, необходимое для производства вирусных частиц, но сама по себе не компетентны для репликации и упаковки. Когда Фагмидную и помощник плазмиды котрансформированы, в одиночку Фагмидную реплицируется на f1 происхождения, упаковывают и секретируется. Векторизованных Фагмидную затем компетентны , чтобы заразить живой E. палочки через пилуса F. В этой системе, эффект глушение производится на заказ Srna кассет, сочетающих последовательность подмостков с целевой-связывающей последовательностью. Мишень-связывающий последовательность 24 пар оснований антисмысловые к мРНК-мишени, как правило, на месте связывания рибосомы (RBS). Последовательность строительных лесов, разработанная Na и коллегами 8, содержит Hfq-связывающий мотив , извлеченный из MICC, небольшой регуляторной РНК эндогенного Е. палочки. Белок Hfq стимулирует РНК-РНК bindinг и деградации мРНК, выступающей роль в этой системе , подобной RISC в RNAi. На рисунке 1 представлена ​​полная схема для фагов опосредованной Срна нокдаунов, в том числе структуры Срна кассеты, фагмидного векторизации и глушителей механизма. В качестве способа для модулирования экспрессии гена в E. палочка, рРНК глушителей является простым, быстрым и универсальным. Целенаправленное E. палочка не обременены за распространяющейся фагмиды и выражая Срна. Это может иметь важное значение в контексте синтетической биологии или фундаментальных исследований , где экспрессия гетерологичных больших конструкций может напрягать клеточные ресурсы 9. Фагмиды с новыми целями могут быть получены с помощью одного ПЦР и собирали через один день после фагмидного трансформации. Наконец, практически любой мРНК могут быть направлены. Регулирование кассета Срна (на стандартной плазмиды) было показано , что работать на различных целей в обмене веществ с типичными уровнями репрессии&gt; 90% 8. 10. Во- первых, упакованный Фагмидную вводят в периодической культуре Е. клетки палочки и использовали для подавления экспрессии флуоресцентного белка mKate2. Последующие изменения флуоресценции контролируются в режиме реального времени. Во-вторых, сбивание ген CAT показано, чтобы уменьшить фенотипическую устойчивость к хлорамфениколу на чашках. В обоих случаях сама Фагмидную несет GFP маркер, позволяя зараженность быть измерена независимо от нокдауна эффективности.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="637">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:135px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DpnI Enzyme</td>
			<td style="width:135px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phusion High Fidelity Polymerase</td>
			<td style="width:135px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taq 2x Master Mix</td>
			<td style="width:135px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0270L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M13KO7 Helper Phage</td>
			<td style="width:135px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0315S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TOP10F&#39; Cells</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C3030-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB Broth</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L3022-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9393-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">60615-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">87128-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phage-mediated delivery of targeted srna constructs to knock down gene expression in e. coli

РНК-опосредованный нокдаун широко используются для контроля экспрессии генов. Этот универсальный семейство методов использует короткие РНК (рРНК), которые могут быть синтезированы с любой последовательностью и предназначенной для дополнения любого гена, предназначенные для глушителей. Поскольку рРНК конструкции могут быть введены для многих типов клеток непосредственно или с использованием различных векторов, экспрессия генов может быть подавлено в живых клетках без трудоемкого генетической модификации. Наиболее распространенной РНК нокдаун технологии, РНК-интерференции (RNAi), использует распознавания эндогенных РНК-индуцированного глушителей комплекса (RISC), чтобы опосредовать последовательности и расщепление мРНК-мишени. Применение данной методики поэтому ограничены к РИСКовским экспрессирующих организмов, в первую очередь эукариот. В последнее время новое поколение РНК биотехнологов разработали альтернативные механизмы для контроля экспрессии генов с помощью РНК, и таким образом стало возможным РНК-опосредованного нокдауна генов у бактерий. Здесь мы опишем метод для глушителей генов ExpresSion в Е. палочка , которая функционально напоминает RNAi. В этой системе синтетический Фагмидную предназначен для выражения Срна, который может нацеленная на любой последовательности. Выражение конструкция доставляется к популяции E. Клетки палочки с не литического фага М13, после чего он способен стабильно репликации в качестве плазмиды. Распознавание Антисенс и глушение мРНК - мишени опосредуется белком Hfq, эндогенной по отношению к E. палочки. Этот протокол включает в себя методы проектирования антисмысловую Срна, построения фагмидных вектора, упаковки фагмиду в M13 бактериофага, готовя население живых клеток для инфекции, а также выполнение самой инфекции. Флуоресцентный белок mKate2 и хлорамфениколацетилтрансферазу ген устойчивости к антибиотику (CAT) предназначены для создания репрезентативных данных и количественной оценки эффективности нокдаун.

Watch this Scientific Journal Video about Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli at JoVE.com

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.

Фаг-опосредованной доставки целевых рРНК Создаёт к нокдауна экспрессии генов в<em&gt; E. палочки</em

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be ...

phage-mediated-delivery-targeted-srna-constructs-to-knock-down-gene

Research

JoVE Journal

Biology

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

12.5K Views.  Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Université Paris Descartes. We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.

Video: Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Подготовка первичных гемопоэтических клеточных культур из костного мозга мышей для Электропорация

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Использование генной Pulser MXcell Электропорация системы для трансфекции первичных элементов с высоким КПД

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, compromising downstream analyses. Considering the complex and dynamic cellular associations existing within many tissues, in order to recapitulate the in vivo interactions thorough molecular analysis one must be able to analyze specific cell populations within their native context. Laser-mediated microdissection can achieve this goal, allowing unambiguous identification and successful harvest of cells of interest under direct microscopic visualization while maintaining molecular integrity. We have applied this technology to analyse gene expression within defined areas of the developing Drosophila wing disc, which represents an advantageous model system to study growth control, cell differentiation and organogenesis. Larval imaginal discs are precociously subdivided into anterior and posterior, dorsal and ventral compartments by lineage restriction boundaries. Making use of the inducible GAL4-UAS binary expression system, each of these compartments can be specifically labelled in transgenic flies expressing an UAS-GFP transgene under the control of the appropriate GAL4-driver construct. In the transgenic discs, gene expression profiling of discrete subsets of cells can precisely be determined after laser-mediated microdissection, using the fluorescent GFP signal to guide laser cut. 
Among the variety of downstream applications, we focused on RNA transcript profiling after localised RNA interference (RNAi). With the advent of RNAi technology, GFP labelling can be coupled with localised knockdown of a given gene, allowing to determinate the transcriptional response of a discrete cell population to the specific gene silencing. To validate this approach, we dissected equivalent areas of the disc from the posterior (labelled by GFP expression), and the anterior (unlabelled) compartment upon regional silencing in the P compartment of an otherwise ubiquitously expressed gene. RNA was extracted from microdissected silenced and unsilenced areas and comparative gene expression profiling determined by quantitative real-time RT-PCR. We show that this method can effectively be applied for accurate transcriptomics of subsets of cells within the Drosophila imaginal discs. Indeed, while massive disc preparation as source of RNA generally assumes cell homogeneity, it is well known that transcriptional expression can vary greatly within these structures in consequence of positional information. Using localized fluorescent GFP signal to guide laser cut, more accurate transcriptional analyses can be performed and profitably applied to disparate applications, including transcript profiling of distinct cell lineages within their native context.

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser microdissection was applied to analyse gene expression profiling in specific compartments of Drosophila wing disc subjected to localised RNAi in vivo. RNA extracted from equivalent areas of silenced and unsilenced compartments was analysed by quantitative RT-PCR to determine comparative gene expression profiling within the context of native tissue microecology.

Лазерная микродиссекция Применительно к экспрессии генов Профилирование подмножество ячеек из Drosophila Крыло диска

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Использование автоматизированных счетчиков сотовый для упрощения исследования экспрессии генов: миРНК Нокдаун ИЛ-4 зависимости экспрессии генов в клетках Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Мутагенеза и функциональные Выбор протоколов для направленной эволюции белков в Е. палочки</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

В пробирке восстановление активность Т. castaneum Теломераза

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Анализ глобальной РНК синтеза на уровне одной клетки следующем Гипоксия

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

Высокая пропускная количественном выражении Скрининг и очистка Применительно к рекомбинантный дисульфид-богатые Venom белков, продуцируемых в<em&gt; Е. палочка</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

Кратковременная экспрессия белков гидродинамическими доставки генов у мышей

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

миРНК Скрининг для идентификации Убиквитин и Убиквитин-подобной системе регуляторов биологических путей в культивируемых клетках млекопитающих

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Фаг-опосредованной доставки целевых рРНК Создаёт к нокдауна экспрессии генов в

Резюме

Смотреть дополнительные видео

PLAYLIST