Name: culturing human pluripotent and neural stem cells in an enclosed cell culture system for basic and preclinical research
Uploaded: 2016-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research at JoVE.com

Авторы хотели бы выразить благодарность сотрудникам в Biospherix за их помощь в обучении использовать Xvivo закрытую систему культивирования клеток, особенно Matt Freeman; сотрудники Miles &amp; Kelley Construction Company, Inc. для их работы в создании лабораторной инфраструктуры, особенно Russ Hughes; сотрудники Детской больницы Orange County департамента средств и служб поддержки для обеспечения их работы в координации лабораторных реконструируют, особенно Адам Lukhard и Девин Hugie; сотрудники Детской больницы Orange County отдела информационных систем за их помощь в создании инфраструктуры управления данными и удаленный доступ, особенно Viet Tran; Детская больница группы Исполнительного управления Orange County за многолетнюю поддержку проекта, особенно д-ра Марии Minon и Brent Dethlefs. Эта работа была профинансирована Детской больницы Orange County и Калифорнийского института регенеративной Medicinе через грант TR3-05476 к PHS. Все авторы внесли одинаковый вклад в эту работу.

<ol>
	<li>Brick, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Autism+Spectrum+Disorders+Stem+Cell+Resource+at+Children's+Hospital+of+Orange+County:+Implications+for+Disease+Modeling+and+Drug+Discovery.">The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery.</a> Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).</li><li>Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+by+lentiviral+transduction.">Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction.</a> Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).</li><li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+HIF1alpha+repress+the+differentiative+effects+of+BMPs+in+high-grade+glioma.">Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma.</a> Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).</li><li>Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+controls+the+expansion+of+human+CNS+precursors+and+the+generation+of+astrocytes+and+oligodendrocytes.">Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes.</a> Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).</li><li>Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+non-viable+airborne+particles+correlates+with+airborne+colonies+and+represents+an+acceptable+surrogate+for+daily+assessment+of+cell-processing+cleanroom+performance.">Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance.</a> Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).</li><li>Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+stem+cell+therapies+for+neurological+diseases.">The potential of stem cell therapies for neurological diseases.</a> Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).</li><li>Schwartz, P. H., Brick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapies+for+the+lysosomal+storage+diseases+-+the+quintessential+neurodegenerative+diseases.">Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases.</a> Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).</li><li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture.">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).</li><li>Stover, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process-based+expansion+and+neural+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+for+transplantation+and+disease+modeling.">Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling.</a> J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).</li><li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging.">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).</li><li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Клетки, выращенные в РПС не видят каких-либо изменений в атмосфере кислорода или углекислого газа концентрации, как они перемещаются из инкубатора в камеру обработки с микроскопом камеру и обратно. Очень важно, чтобы условия в каждой камере сопоставляются с конкретным инкубаторе, в котором клетки хранятся до того, как клетки удаляются из инкубатора. Атмосфера внутри аппарата непрерывно НЕРА-фильтром и настраивается в отношении концентрации кислорода и двуокиси углерода. Клетки могут быть выращены при стандартных концентрациях для ЧОК или NSCs, 5% и 9%, соответственно; или альтернативные концентрации могут быть выбраны для различных типов клеток или для конкретных экспериментов. Таким образом, устройство поставляется с постоянными источниками медицинской чистоты кислорода, углекислого газа и азота (рисунок 4). Все три из этих газов снабжены газом конкретных систем коллектора, которые обеспечивают постоянные поставки. Устройство также поставляется с калибровочным газовой смеси, состоящей из10% (± 0,01%) двуокиси углерода в кислороде. Многообразие систем расположены за пределами производственной ячейки объекта и газы по трубопроводу в средство через потолок. Калибровочного газа расположен в пределах объекта. Устройство дополнительно снабжен вакуумом, также через потолок. Используя электронную систему мониторинга и беспроводной отправки единиц, выходное давление всех коллекторов постоянно контролируются. В том случае, если какое-либо давление выпадает из диапазона, операторы установки по производству ячейки автоматически позвонил по телефону и уведомление таким образом, что соответствующие меры могут быть приняты. Требования к мощности аппарата выполнены шестью выделенными 120 V цепей, спускающимися с потолка и соединен с резервными генераторами больницы, чтобы обеспечить постоянное снабжение. Работа устройства управляется с помощью программного обеспечения на компьютере на базе ПК через источник бесперебойного питания. Эти силовые и компьютерные устройстваубедитесь, что система функционирует непрерывно, даже в случае выхода из строя системы публичной власти. Программное обеспечение управления устройством имеет удобный графический интерфейс (рисунок 1) , который позволяет для контроля концентрации кислорода и углекислого газа, а также давления температуры, влажности и камеры. Значения всех этих параметров непрерывно записываются, чтобы обеспечить бегущую запись всех параметров аппарата. Эти данные резервное копирование на удаленный сервер каждую ночь, чтобы защитить их целостность. Компьютер и программное обеспечение можно получить удаленный доступ административными пользователями для оценки и / или изменить любой параметр. Кроме того, компьютер и программное обеспечение можно получить удаленный доступ, что позволяет интерактивной оценки параметров аппаратуры и устранение неполадок с локальными пользователями. Дополнительный сигнал тревоги блок передачи соединен с устройством таким образом, чтобы операторы производства сотового объекта уведомляются о любом из-за допустимые пределы состояния аппарата. Удаленный доступ сapabilities позволяют войти и оценка особенностей состояния вне диапазона. Аппарат выполнен в виде модульной системы как в макро и микро смысле. Модули Отдельные культура клеток, такие как инкубаторы и обработки камер, могут быть настроены в отношении их размеров и требований, а также в их расположение по отношению друг к другу. Кроме того, большинство функций управления отдельными модулями являются сами модульное таким образом, что отдельные контроллеры атмосферный газ, например, может быть легко заменен без существенного сбоев в системе. Специализированные камеры обработки, например, один для микроскопического визуализации и манипуляций с культурами клеток, легко адаптируются к системе. Оба фазового контраста и флуоресцентный микроскоп находятся внутри системы (рисунок 6) таким образом , что клетки могут быть живой окрашенном, и колонии могут быть расчленены в тех же атмосферных условиях, в тон инкубаторы. Прокладка кабелей через герметичные прокладки в боковых стенках рабочей камеры позволяет такое оборудование, как источники питания и компьютеры , которые будут храниться вне устройства, как правило , на тележке (рисунок 6). Камеры для обработки в производственном объекте ячейки имеют различный характер воздушного потока по сравнению с обычными КБС. В обычных БББ, воздушный поток стекает вниз из центрального выпускного отверстия и разделяется на два отдельных потока, которые затем обрабатывают с помощью двух различных отверстий для забора в передней и задней части пола шкафа. В противоположность этому, СПЛ имеет один отверстие в передней части потолка. Воздух течет вниз и по направлению к задней части камеры, где он затем обращается вверх в отверстие для забора воздуха. Хотя СПЛ по своей сути очень чистый, этот уникальный образец потока воздуха означает, что технические специалисты должны слегка скорректировать свою технику, чтобы уменьшить риск заражения. Как и с обычным BSC, лаборатории работника сhould Избегайте размещения их руки перед открытыми планшеты для культивирования клеток и медиа-бутылок. Тем не менее, направление, которое находится выше по течению было изменено в ЦПС Объект производственной лаборатории клетка сама по себе является довольно стандартным и оснащен C морозильнике -20 °, -80 ° C морозильнике, 4 ° C холодильник, центрифуга и водяная баня. В лаборатории также имеется раковина с педалей управления для удобной работы без участия рук. Для того, чтобы этой лаборатории, чтобы стать функциональной клинической производственной ячейки объекта, однако, несколько дополнительных модификаций еще должны быть сделаны. Во-первых, сам аппарат должен быть повышен, чтобы иметь возможность отслеживать летучих органических соединений, частиц и концентрации диоксида хлора, который используется для обеззараживания. Во-вторых, рабочая камера, содержащая машину FACS может быть размещен и соединен с остальной частью аппарата через буфер модуля. Это позволит для сортировки и очистки тр клетокпопуляции ansplantable клеток при соответствующих условиях окружающей среды. И, наконец, весь аппарат должен быть размещен внутри мягкой стены чистой комнате. Это обеспечивает Международная организация по стандартизации (ISO) класс 8 среды для устройства 5. Высокой стерильности и компьютерным управлением характер СПЛ делает его идеальной системой для будущих приложений с клеточной терапии и хороших производственных процессов. Риск заражения значительно смягчены, но что более важно, условия расширения ячейки автоматически записываются и архивируются с помощью компьютерной системы. Отклонения в концентрации газа, температуры, влажности и всех событий доступа в систему строго документированы. Это может значительно помочь при исследовании проблемы качества продукции. Тем не менее, все еще существуют ограничения. Использование любых и всех реагентов и расходных материалов (например, компоненты среды, пипеток, тарелки) должны быть задокументированы отдельно. Добавитьitionally, существует множество потенциальных проблем (в том числе многих форм человеческой ошибки), которые могут возникнуть, которые абсолютно не связаны с переменными документированных системы мониторинга ПСЛ. Таким образом, потребность в хорошо подготовленных кадров и детальной ручной документации задач остается на месте.

Standard stem cell culture techniques suffer from several environmental constraints that place undue stresses on the cells and expose the cells to unacceptable risks of contamination. Among the stresses that cells may endure under standard cell culture conditions are precipitous changes in the levels of carbon dioxide and oxygen concentrations3,4. This occurs when the cells are moved from the incubator to the biosafety cabinet and/or microscope which may not be optimal for the cells. Previous studies have confirmed the advantages of culturing both pluripotent and neural stem cells in hypoxic conditions4,11, and for best results, these conditions need to be continuous. Moreover, risks of cellular contamination are higher as the laboratory environment and personnel impinge upon the cells at almost every step of their culture and manipulation. Traditional clean rooms comprise one effective method to greatly decrease contamination risks but they are expensive, have a large footprint and fail to address stressors related to carbon dioxide and oxygen concentrations. 
A cell production facility that can address both contamination risks and gas concentrations and that can be qualified to meet cGMP criteria9 provides high quality cells for basic science research as well as clinical applications1,6,7. Such a cell production facility consists, at a minimum, of the following components: a process chamber, which acts as a heated workspace for the feeding and manipulation of cell cultures; a laminar flow hood, for the initial sterilization of reagents, tubes, and tools; two buffering airlock chambers in between the hood and the process chamber; two cell culture incubators accessible from the process chamber; a microscope chamber adjacent to the process chamber; and finally, computer software to set and monitor the conditions within these modules. Using this basic infrastructure, a wide variety of tasks can be performed, such as standard feeding and passaging of pluripotent stem cells and multipotent neural stem cells, as well as more specialized methods like Sendai virus-based reprogramming, in vitro migration studies, and differentiation of neural stem cells for electrophysiological characterization.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;i&gt;Xvivo System&lt;/i&gt;</td><td>Biospherix</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>&lt;i&gt;Xvivo&lt;/i&gt; Software</td><td>Biospherix</td><td>version i.o.2.1.2.1</td><td></td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Manifold</td><td>Amico</td><td>P-M2H-C3-S-U-OXY</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Manifold</td><td>Amico</td><td>M2H-C3-D-U-CO2</td><td></td></tr><tr><td>N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Manifold</td><td>Western Innovator</td><td>CTM75-7-2-2-BM</td><td></td></tr><tr><td>Microscope with DP21 camera and fluorescence</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>StemPro hESC Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>A100006-01</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Sodium</td><td>Hyclone</td><td>9236</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor 2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AFL233</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Protide</td><td>PP1130</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s-based Cell dissociation Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AFL236</td><td></td></tr><tr><td>Oct-3/4 Antibody</td><td>Millipore</td><td>AB3209</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4260</td><td></td></tr><tr><td>SSEA4 Antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>BIT-9500 Serum Supplement</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Consumable Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml Serological pipet</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Serological pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-102</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Serological pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Serological pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-106</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Serological pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-107</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>T25 flask</td><td>TPP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>T-75 flask</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;micro;l pipet tips</td><td>Eppendorf</td><td>22491130</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l pipet tips</td><td>Eppendorf</td><td>22491148</td><td></td></tr><tr><td>1,000 pipet tips</td><td>Eppendorf</td><td>22491156</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Thermo Scientific</td><td>5000.102</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>BDH</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Sanimaster 4</td><td>Ecolab</td><td>65332960</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td>A714239</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing human pluripotent and neural stem cells in an enclosed cell culture system for basic and preclinical research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Эта рукопись описывает в некоторых деталях производственной ячейки объекта, а также уникальные аспекты культивирования клеток внутри замкнутой системы. Основная часть производственной ячейки объекта включает в себя заказные, закрываемый, культуры клеток аппарат , который имеет небольшие размеры и может быть легко смонтированные в 6 х 7,5 м 2 комнатной (рисунок 2). Ни в какое время являются клетки внутри аппарата воздействию лабораторного персонала и окружающей среды. Устройство состоит из нескольких модулей: технологическую камеру, ламинаре, 2 буферизация Airlock камер в между капотом и рабочей камеры, двух инкубаторах клеточных культур и микроскопа камеры , прилегающей к рабочей камере (рисунок 3). Система управляется с помощью программного обеспечения , позволяющего экологические переменные , которые будут управляться и контролироваться (Рисунок 1). Компьютер это программное обеспечение находится на источник бесперебойного питания. Газы подают в гоэлектронной системы с помощью набора коллекторы для кислорода, азота и углекислого газа (рисунок 4). Газы для устройства снабжены разнообразными системами, которые имеют два комплекта танков каждый - активный набор и набор резерва. Когда активный набор обращается вниз, коллектор автоматически переключается на резервные и установлены на персонал запасных заказ танков. Питания на резервную систему генератора. Плюрипотентных и нервные стволовые клетки можно выращивать в условиях гипоксии в этом объекте с использованием ранее разработанных протоколов 9, с дополнительными осложнениями , присущих новому оборудованию. Плюрипотентные стволовые клетки могут быть получены с использованием вируса Сендай, используя плюрипотентности-специфических антител для идентификации полностью трансфектированных колоний, которые затем выделяют и развернутые. (Рисунок 5А и В), Из этих ИПСК, нервные стволовые клетки и нейроны могут быть получены с помощью ингибирования двойной Smad, и их фенотип проверены USI<html> нг NSC-специфических антител (рис 5С и D). <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig1.jpg" /> Рисунок 1. Графический интерфейс для объекта Cell Production. (А) Графическое представление СПЛ является экран по умолчанию и соответствует чертеж CAD , показанный на рисунке 3. Щелчок мыши над буфером модуль 1 (2F на рисунке 1) открывает экран управления (B) , где 2 значения O устанавливаются в соответствии с рабочей камере (3 на рисунке 3). Точно так же, нажав на технологической камере или Инкубатор 1 приносит свои соответствующие экраны управления (C и D, соответственно), где значения могут быть изменены или отслеживаемые в зависимости от обстоятельств.<html> rget = &quot;_blank&quot;&gt; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig2.jpg" /> Рисунок 2. Клетка производственном объекте. (А) Система , как видно из переднего правого ракурса. Обратите внимание на электрические и газовые соединения на потолке и тележку с микроскопом и аксессуаров компьютера справа. (B) Капот ламинарный поток с дверями доступа к буферу модулей видно справа. (C) Процесс камеры с двумя инкубаторы (черные двери) видно сзади. (D) Вид через правую сторону системы , показывающий микроскоп и монитор с дверями в буфер камеры видно на расстоянии. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> т &quot;ВОК: Keep-together.within-страница =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig3.jpg" /> Рисунок 3. Чертеж САПР Объекта сотового Production. Все детали , поступающие на устройство, сначала протирать спиртом и сушат на воздухе в вытяжном шкафу с ламинарным потоком воздуха (1). Элементы затем переходит к соответствующей атмосферы в модуле передней буферной (2F) перед поступлением в модуль UCPC, или технологическую камеру (3). Клетки культивируют в двух инкубаторах (4, 5). Живая клетка окрашивания, собирание колонии, оценка общей клеточной морфологии и анализа миграции происходит в модуле UPC или микроскоп камера (6). И, наконец, отходы выходит из системы через модуль заднего буфера (2R). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть большую версию этого рисунка.</a> &lt;<html> / Р&gt; <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig4.jpg" /> Рисунок 4. Источники газов и Силы. (A) CO 2 многообразие является установка 4 х 4 , как она поставляет все инкубаторы лаборатории. (B) O 2 многообразие представляет собой 2 х 2 установки и расходные материалы только производство ячейки объекта. Азот для системы генерируется в испарителе (C, как раз под знаком выход) , присоединенные к жидким азотом коллектора (справа) , который также автоматически заполняет cryofreezers (внизу слева). Многообразие является установка 2 х 2 подается двумя парами 160 л танков жидкого азота. CO 2, O 2, N 2 и поставляются с потолка через отсечные (D). вакуумный дом также поставляется в этом месте. Видел только за поставки газа отключений являются парой силовых кабелей, которые поставляют питание системы.F = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg&quot; целевых = &quot;_blank&quot;&gt; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. <img alt="Рисунок 5" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig5.jpg" /> Рисунок 5. плюрипотентные стволовые клетки , полученные в Гипоксия с вирусом Сендай. (A) SC187-SF4-2I0-E3 иПСК иПСК (номенклатура найдены в Стовера и др. 9), фазовый контраст 10x. (B) SC88.1-UH1-2I0 иПСК живой окрашивали AF-594-меченым TRA-1-60, разведение 1: 100 в средствах массовой информации. Все иПСК были трансдуцированных в производственном объекте клеток в 5% O 2 с вирусом Сендай. (C) Фаза контраст SC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6 IPSC-производных NSCs, выращенных при 5% O 2 в камере слайдов. Затем клетки фиксировали в 4% параформальдегида и окрашивали анти-человеческим Nestin первичным антителом, и Алекс-488 вторичное антитело. Все масштабные линейки находятся на 1001; м . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research at JoVE.com

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Культивирование Человеческий плюрипотентных и нервные стволовые клетки в замкнутой системе клеточной культуре фундаментальных и доклинических исследований

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

culturing-human-pluripotent-neural-stem-cells-an-enclosed-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.2K Views.  Childrens Hospital of Orange County Research Institute. Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Video: Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of interest. Nevertheless, an ideal humanized ex vivo feeder-free propagation method for hPSCs has not been developed; currently, additional exogenous substrates including basic fibroblast growth factor (bFGF), a master hPSC-sustaining factor, is added to all of culture media and synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures. Recently, our group developed a simple and efficient protocol for the propagation of hPSCs using only conditioned media derived from the human placenta on a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or synthetic substrata specific to hPSCs. This protocol has not been reported previously and might enable researchers to propagate hPSCs efficiently in humanized culture conditions. Additionally, this model obviates hPSC contamination risks by animal products such as viruses or unknown proteins. Furthermore, this system facilitates easy mass production of hPSCs using the gelatin coating, which is simple to handle, dramatically decreases the overall costs of ex vivo hPSC maintenance.

This protocol provides a simple and efficient way to propagate human pluripotent stem cells (hPSCs) using only conditioned media derived from the human placenta in a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or hPSC-specific synthetic substrata.

Роман Культура модель человека плюрипотентных стволовых клеток Распространение на Желатин в Плацента-баром СМИ

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Passaging Human Neural Stem Cells

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes as well as to explore many fundamental processes of human neural development and pathology.  This protocol presents a simple method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of standardizing this technique and increasing reproducibility of human stem cell research.  The hNSPCs we use were isolated from cadaveric postnatal brain cortices by the National Human Neural Stem Cell Resource and grown as adherent cultures on flasks coated with fibronectin (Palmer et al., 2001; Schwartz et al., 2003).  We culture our hNSPCs in a DMEM:F12 serum-free media supplemented with EGF, FGF, and PDGF and passage them 1:2 approximately every seven days.  Using these conditions, the majority of the cells in the culture maintain a bipolar morphology and express markers of undifferentiated neural stem cells (such as nestin and sox2).

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro allows to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes and to explore human neural development. This protocol presents a method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of increasing reproducibility of human stem cell research.

Пассирования правам нервные стволовые клетки

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for ...

Biology

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

Генерация нервные стволовые клетки из эмбриона человека Выкинуть корковой ткани

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Эффективное Вывод прав нейронов и нейронов прародителей из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека с малыми Индукционная Молекула

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

Эффективная нейронная дифференциация с использованием одноклеточной культуры эмбриональных стволовых клеток человека

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Индуцированная дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток с использованием автоматизированной системы культивирования

An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, including the elucidation of rare disease pathologies, the development of new medicines, and regenerative medicine aiming to restore damaged organs. Despite this, the social implementation of hiPSCs is still limited. This is partly because of the difficulty of reproducing differentiation in culture, even with advanced knowledge and sophisticated technical skills, due to the high sensitivity of iPSCs to minute environmental changes. The application of an automated culture system can solve this issue. Experiments with high reproducibility independent of a researcher's skill can be expected according to a shared procedure across various institutes. Although several automated culture systems that can maintain iPSC cultures and induce differentiation have been developed previously, these systems are heavy, large, and costly because they make use of humanized, multi-articulated robotic arms. To improve on the above issues, we developed a new system using a simple x-y-z axis slide rail system, allowing it to be more compact, lighter, and cheaper. Furthermore, the user can easily modify parameters in the new system to develop new handling tasks. Once a task is established, all the user needs to do is prepare the iPSC, supply the reagents and consumables needed for the desired task in advance, select the task number, and specify the time. We confirmed that the system could maintain iPSCs in an undifferentiated state through several passages without feeder cells and differentiate into various cell types, including cardiomyocytes, hepatocytes, neural progenitors, and keratinocytes. The system will enable highly reproducible experiments across institutions without the need for skilled researchers and will facilitate the social implementation of hiPSCs in a wider range of research fields by diminishing the obstacles for new entries.

В центре внимания автора: Автоматизация культуры iPSC для повышения воспроизводимости 

Here, we present a protocol for an automated cell culture system. This automated culture system reduces labor and benefits the users, including researchers unfamiliar with handling induced pluripotent stem (iPS) cells, from the maintenance of iPS cells to differentiation into various types of cells.

Автоматизированная система культивирования для поддержания и дифференцировки индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Альтернативные Культуры для человека плюрипотентных стволовых клеток производство, техобслуживание, и генетический анализ

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Смешанные клеточные культуры мозга эмбриональной мыши для изучения инфекции и врожденного иммунитета

Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of neurons, astrocytes, oligodendrocytes, and microglia. Due to increasing efforts to replace and reduce animal use, a variety of in vitro cell culture systems have been developed to explore innate cell properties, which allow the development of therapeutics for CNS infections and pathologies. Whilst certain research questions can be addressed by human-based cell culture systems, such as (induced) pluripotent stem cells, working with human cells has its own limitations with regard to availability, costs, and ethics. Here, we describe a unique protocol for isolating and culturing cells from embryonic mouse brains. The resulting mixed neural cell cultures mimic several cell populations and interactions found in the brain in vivo. Compared to current equivalent methods, this protocol more closely mimics the characteristics of the brain and also garners more cells, thus allowing for more experimental conditions to be investigated from one pregnant mouse. Further, the protocol is relatively easy and highly reproducible. These cultures have been optimized for use at various scales, including 96-well based high throughput screens, 24-well microscopy analysis, and 6-well cultures for flow cytometry and reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) analysis. This culture method is a powerful tool to investigate infection and immunity within the context of some of the complexity of the CNS with the convenience of in vitro methods.

В центре внимания автора: Создание смешанных культур нейронных и глиальных клеток из эмбрионального мозга мышей для изучения инфекции и врожденного иммунитета  

This protocol presents a unique way of generating central nervous system cell cultures from embryonic day 17 mouse brains for neuro(immuno)logy research. This model can be analyzed using various experimental techniques, including RT-qPCR, microscopy, ELISA, and flow cytometry.

Создание смешанных культур нейрональных и глиальных клеток из эмбрионального мозга мыши для изучения инфекции и врожденного иммунитета

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of ...

Культивирование Человеческий плюрипотентных и нервные стволовые клетки в замкнутой системе клеточной культуре фундаментальных и доклинических исследований

Резюме

Смотреть дополнительные видео

PLAYLIST