Name: rapid in vivo assessment of adjuvant's cytotoxic t lymphocytes generation capabilities for vaccine development
Uploaded: 2018-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development at JoVE.com

Мы в долгу перед нашими техническими помощниками: ю. Bröder и х. Shkarlet, который помог нам в ходе экспериментальных процедур. Эта работа была частично финансируется ЕС гранты (UniVax, контракт № 601738 и TRANSVAC2, контракт № 730964) и Грант Гельмгольца (Хай-IDR). Источники финансирования не влияют исследования дизайн, поколения рукопись или решение представить его для публикации.

Все устройства, используемые в данном исследовании были от фона C57BL/6. Все животные находились в условиях свободной от возбудителя. Все эксперименты проводились согласно нормативной немецкого животного закона о защите (TierSchG BGBl. Я S 1105; 25.05.1998) и были утверждены Комитетом Нижняя Саксония по этике животных экспериментов и государственное управление (Нижняя Саксония государственного управления защиты прав потребителей и безопасность пищевых продуктов), под номером разрешения 33,4-42502-04-13/1281 и 162280.
1. CFSE окрашивание OT-я T клетки и приемных передачи
Примечание: OT-я мышей являются transgenically сгенерированный животных, которые выражают Т-клеточных рецепторов (TCR) с фиксированной α и β-цепи, которые вместе признаем иммуно доминантный пептид OVA, SIINFEKL10,11. В результате, эти мыши имеют значительно большое количество CD8 специфичные для SIINFEKL+ Т-клеток (97%)12 по сравнению с нормальным или OVA-прививки мышей (≤ 1%)13.
<ol><li>Изоляция прослеживается CD8 клетки+ T от OT-я мышей, выражая Т лимфоцитов конкретных Thy1 (Thy1.1) аллеля:<ol>
<li>Усыпить OT 6-9 недель-я мышей с CO2 ингаляции следуют шейки матки дислокация14. Вскрыть селезенки и крупных лимфатических узлов (паховые, подмышечные и шейки матки пар только) путем разрезания кожи с Ножницы хирургические, отсоединение кожу от тела с помощью хирургического клещи и щипцы и поместите их в чашках Петри (60 x 15 мм) каждый из которых содержит 100 мкм поры Кубок сетки для выпуска шлифовка и клеток тканей.</li>
		<li>Поддерживать Петри (каждый с одной сетки Кубок) в 3-5 мл полного RPMI среды (RPMI 1640, 10% v/v FCS, 100 ед/мл пенициллин, стрептомицин 50 мкг/мл) хранится на льду.</li>
		<li>Размять органов с помощью поршень шприца или аналогичные стерильного инструмента (не требуется предварительного резки) и собирать результате подвеска одну ячейку в 15 мл пробирок.</li>
		<li>Центрифуга суспензию клеток на 300 g x 10 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант. Вымыть клетки в 10 мл холодного PBS центрифугированием и лизируют эритроцитов из селезенки, вновь приостановить гранулы в 1 мл/селезенки хлорид аммония буферу (ACK, коммерчески доступных). Инкубировать клетки для 1,5 мин на льду и впоследствии вымыть клетки с 10 мл холодного PBS центрифугированием (как раньше).</li>
		<li>Вновь приостановите гранулы в же трубку в 1 мл сыворотки PBS (рН 7,2) содержащий 5% плода говядину для магнитных изоляции.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Чтобы выполнить магнитного изоляции, перейти к негативный выбор CD8+ T клетки, используя набор магнитных изоляции согласно инструкции производителя или опубликованные протоколы15.</li>
	<li>Для выполнения CFSE окрашивание, сначала подсчитать количество CD8+ T клетки, полученные из OT-я мышей с помощью автоматизированных ячейки счетчика (счетчик частиц). Пятно 1-5 x 107 кл/мл в объеме 1-5 мл с 5 мкм CFSE в PBS для 7 минут при 37 ° C, защищенное от света в трубу 15-од Сокола.</li>
	<li>Утолить окрашивание CFSE путем добавления такой же объем (1:1) плода бычьим сывороточным клетки и проинкубируйте дополнительные 7 минут при 37 ° C, защищать от света. Вымойте клетки с 10 мл PBS дважды.</li>
	<li>Подсчет количества ячеек, используя счетчик автоматизированных клеток. Задать номер ячейки до 3-5 x 107 клеток/мл PBS для того, чтобы придать 3-5 х 106 клеток/мышь в 100 мкл внутривенно (и.в.) через Вену хвост.</li>
	<li>Для выполнения инъекции Вену хвост, иммобилизации мышей в соответствующие взводы. Теплый, спины и хвоста мышей, чтобы быть введены, используя красный свет лампы, помещается между 20-25 см от мышей для 1-3 мин позволить хвост вен вазодилатации. Примечание: Это помогает легкости обнаружения вен и отправления суспензию клеток.</li>
	<li>Обеспечения (с рукой, размещенных между мышей и лампа) что это не слишком горячей для мышей и когда отчетливо видны Вены хвост, переходите к инъекции. Inject клетки в боковой или спинной хвост ключе, используя шприц 1 мл с 25-иглы16.</li>
</ol>2. Иммунизация (Эндо свободный OVA + / адъювантной)
<ol><li>Место мыши, пересаженные с OT-я клетки (шаг 1.7, рис. 1) в камеру анестезии и администрирование изофлюрановая кислорода в анестезия машины14.</li>
	<li>Когда мышь полностью спит под наркозом, вынимают из камеры и брить мех мыши на области над ягодичной superficialis (боковые в пояснице) с помощью электрического волос Кромкообрезной станок, для выполнения чистого впрыска с хорошим видом области приложения.</li>
	<li>Придать 50 мкл вакцины, s.c. в районе бритая, с использованием 25-иглы.</li>
</ol>3. изоляция лимфоцитов и пятнать для потока Cytometry анализ
<ol><li>Изоляция лимфоцитов и splenocytes<ol>
<li>Усыпить прививки мышей с CO2 ингаляции следуют шейки матки дислокации.</li>
		<li>Экстракт крылом и отдаленных лимфатических узлах и селезенке и поместите их в отдельный Петри, содержащие 100 мкм поры сетки чашки для выпуска шлифовка и клеток тканей. Выполните шаги 1.1.2 через 1.1.3.</li>
		<li>Декант надосадке после центрифугирования и вновь приостановить клетки окатышей в том же объеме остаток PBS (около 100 мкл).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Пятнать для анализа потока цитометрии<ol>
<li>В 15 мл пластиковых пробирок Подготовьте мастер смеси, содержащие окрашивание антител в концентрациях, изображены в таблице 1, таким образом давая 2 x концентрации окрашивания микс. Готовить достаточное количество мастер смесь, чтобы иметь 100 мкл на сэмпл. Сочетание клетки и мастер смесь 1:1 и Инкубируйте на 4° C на 30 мин. Примечание: Окончательный объем окрашивания на сэмпл должен быть 200 мкл (100 мкл клеток Пелле 100 мкл антител мастер смеси).</li>
		<li>Вымойте клетки центрифугированием дважды, как описано в разделе 1.1.3, добавив 10 мл PBS, дважды.</li>
		<li>Вновь приостановить окрашенных клеток в 0,5-1 мл PBS для приобретения и передачи приостановки потока цитометр трубы. Всегда храните образцы на льду и защищены от света.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. проточной цитометрии
<ol><li>Всегда предварительно отфильтруйте образцы клетки, с помощью фильтров 70-100 мкм.</li>
	<li>Подготовка одного окрашивания компенсации управления флуорофоров, подробно изложены в таблице 1 (бусы или клетки). Примечание: Компенсации следует в цитометр или анализа программного обеспечения17,18,19 и применяется для всех образцов.</li>
	<li>Следуйте стробирования стратегия, изображенный на рисунке 2. Вкратце ворота населения в высоту вперед разброс против вперед разброс области (рисунок 2A) и снова стороне разброс широкий против точечной Сиде (SSA, Рисунок 2B), с тем чтобы исключить Дуплеты.</li>
	<li>Ворота населения от Рисунок 2B путем построения BV 650 (auto флуоресцентным) vs. FITC (CFSE) для того, чтобы дискриминация истинный CFSE окрашенных клеток с высоким авто люминесцентные клеток. Включайте бусы или клетки окрашивали антитело проспряганное BV 650 в компенсации элементы управления. Этот участок (рис. 2 c) BV 650 против FITC используется для ворот OT-я CFSE окрашенных клеток.</li>
	<li>Ворота населения от Рисунок 2 C для Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) vs. APC (CD8) для того, чтобы отличить клетки, полученные от доноров против получателей мышей. Примечание: Клетки, полученные от OT-я мышей доноров являются Thy1.1+ (CD90.1), тогда как WT (C57BL/6, получателя) мышах производный клетки являются Thy1.2+ (CD90.2) (Рисунок 2D). Некоторые лаборатории имеют OT-я мышей в Thy1.2 фон и WT (C57BL/6) в Thy1.1. В этом случае вы должны использовать антитело против Thy1.2 для OT-я мобильных стробирования.</li>
	<li>Заново ворота CD8 клетки+ Thy1.1+ населения путем построения на ворота, включающий 450 BV (CD4) vs. APC (CD8) (рис. 2е).</li>
	<li>Отображение условного 2E рисунок с помощью гистограммы CD8 населения+ клетки показаны CFSE (FITC, канал - синий лазер - 530/15), ворота распространение населения путем включения света от 10-2 до уровня где пристального контроля населения являются (интенсивности ~ 105, в зависимости от эффективности CFSE окрашивание и параметр напряжения на проточный цитометр) (Рисунок 2F).</li>
	<li>Чтобы оценить отмершие клетки параллельно с распространением оценки дополнительные ворота (не отображается на диаграмме 2) построения FITC против L/D маркер (450/20 каналов, УФ лазер).</li>
	<li>Приобрести по крайней мере 5000 событий для элементов управления, компенсации и 10.000 (ворота E, рис.2) от образцов проточный цитометр. Запуск на низкой или средней потока цитометр (не превышает расхода 20.000 события/s).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Krishna, S., Anderson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cell+Epitope+Discovery+for+Therapeutic+Cancer+Vaccines.">T-Cell Epitope Discovery for Therapeutic Cancer Vaccines.</a> Methods Mol Biol. 1403, 779-796 (2016).</li><li>Pinchuk, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD8++T+cell+heptaepitope+minigene+vaccine+induces+protective+immunity+against+Chlamydia+pneumoniae.">A CD8+ T cell heptaepitope minigene vaccine induces protective immunity against Chlamydia pneumoniae.</a> Journal of immunology. 174, 5729-5739 (2005).</li><li>Zhang, J., Silvestri, N., Whitton, J. L., Hassett, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonates+mount+robust+and+protective+adult-like+CD8(+)-T-cell+responses+to+DNA+vaccines.">Neonates mount robust and protective adult-like CD8(+)-T-cell responses to DNA vaccines.</a> Journal of virology. 76, 11911-11919 (2002).</li><li>Marchant, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+CD8(+)+T+lymphocyte+response+to+viral+infection+during+fetal+life.">Mature CD8(+) T lymphocyte response to viral infection during fetal life.</a> J Clin Invest. 111, 1747-1755 (2003).</li><li>Simmons, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+delivery+of+a+respiratory+syncytial+virus+CTL+peptide+with+enterotoxin-based+adjuvants+elicits+protective,+immunopathogenic,+and+immunoregulatory+antiviral+CD8++T+cell+responses.">Mucosal delivery of a respiratory syncytial virus CTL peptide with enterotoxin-based adjuvants elicits protective, immunopathogenic, and immunoregulatory antiviral CD8+ T cell responses.</a> Journal of immunology. 166, 1106-1113 (2001).</li><li>Fulginiti, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+Virus+Immunizationa+Field+Trial+Of+Two+Inactivated+Respiratory+Virus+Vaccines;+An+Aqueous+Trivalent+Paratnfluenza+Virus+Vaccine+And+An+Alum-Precipitated+Respiratory+Syncytial+Virus+Vaccine1.">Respiratory Virus Immunizationa Field Trial Of Two Inactivated Respiratory Virus Vaccines; An Aqueous Trivalent Paratnfluenza Virus Vaccine And An Alum-Precipitated Respiratory Syncytial Virus Vaccine1.</a> American journal of epidemiology. 89, 435-448 (1969).</li><li>Olson, M. R., Varga, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cells+inhibit+respiratory+syncytial+virus+(RSV)+vaccine-enhanced+disease.">CD8 T cells inhibit respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease.</a> Journal of immunology. 179, 5415-5424 (2007).</li><li>Lirussi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+IFN+and+not+TNF,+is+Essential+for+Cyclic+Di-nucleotide-elicited+CTL+by+a+Cytosolic+Cross-presentation+Pathway.">Type I IFN and not TNF, is Essential for Cyclic Di-nucleotide-elicited CTL by a Cytosolic Cross-presentation Pathway.</a> EBioMedicine. 22, 100-111 (2017).</li><li>Ebensen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bis-(3',5')-cyclic+dimeric+adenosine+monophosphate:+strong+Th1/Th2/Th17+promoting+mucosal+adjuvant.">Bis-(3',5')-cyclic dimeric adenosine monophosphate: strong Th1/Th2/Th17 promoting mucosal adjuvant.</a> Vaccine. 29, 5210-5220 (2011).</li><li>Hogquist, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+antagonist+peptides+induce+positive+selection.">T cell receptor antagonist peptides induce positive selection.</a> Cell. 76, 17-27 (1994).</li><li>Clarke, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+ovalbumin-specific+TCR+transgenic+line+OT-I:+MHC+elements+for+positive+and+negative+selection.">Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection.</a> Immunology and cell biology. 78, 110-117 (2000).</li><li>Topham, D. J., Castrucci, M. R., Wingo, F. S., Belz, G. T., Doherty, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+antigen+in+the+localization+of+naive,+acutely+activated,+and+memory+CD8(+)+T+cells+to+the+lung+during+influenza+pneumonia.">The role of antigen in the localization of naive, acutely activated, and memory CD8(+) T cells to the lung during influenza pneumonia.</a> Journal of immunology. 167, 6983-6990 (2001).</li><li>Le Bon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-priming+of+CD8++T+cells+stimulated+by+virus-induced+type+I+interferon.">Cross-priming of CD8+ T cells stimulated by virus-induced type I interferon.</a> Nature immunology. 4, 1009-1015 (2003).</li><li>Otto, K., Bullock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Laboratory Mouse. , 555-569 (2004).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Activation+of+Murine+Lymphocytes.">Isolation and Activation of Murine Lymphocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , (2016).</li><li>Shimizu, S., Bullock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Laboratory Mouse. , 527-542 (2004).</li><li>Breton, G., Lee, J., Liu, K., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+human+dendritic+cell+progenitors+by+multiparametric+flow+cytometry.">Defining human dendritic cell progenitors by multiparametric flow cytometry.</a> Nature protocols. 10, 1407-1422 (2015).</li><li>Kaminski, D. A., Wei, C., Rosenberg, A. F., Lee, F. E. -. H., Sanz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+Flow+Cytometry+and+Bioanalytics+for+B+Cell+Profiling+in+Systemic+Lupus+Erythematosus.">Multiparameter Flow Cytometry and Bioanalytics for B Cell Profiling in Systemic Lupus Erythematosus.</a> Methods in molecular biology. 900, 109-134 (2012).</li><li>Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+workshop+on+fluorescence+compensation+settings+in+multicolor+flow+cytometry.">Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry.</a> Cytometry. Part B, Clinical cytometry. 72, 8-13 (2007).</li><li>Newrzela, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+receptor+diversity+prevents+T-cell+lymphoma+development.">T-cell receptor diversity prevents T-cell lymphoma development.</a> Leukemia. 26, 2499-2507 (2012).</li><li>Iwasaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergen+endotoxins+induce+T-cell-dependent+and+non-IgE-mediated+nasal+hypersensitivity+in+mice.">Allergen endotoxins induce T-cell-dependent and non-IgE-mediated nasal hypersensitivity in mice.</a> J Allergy Clin Immunol. 139, 258-268 (2017).</li><li>Tsuchiya, K., Siddiqui, S., Risse, P. A., Hirota, N., Martin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+LPS+in+OVA+inhalations+affects+airway+inflammation+and+AHR+but+not+remodeling+in+a+rodent+model+of+asthma.+American+journal+of+physiology.">The presence of LPS in OVA inhalations affects airway inflammation and AHR but not remodeling in a rodent model of asthma. American journal of physiology.</a> Lung cellular and molecular physiology. , L54-L63 (2012).</li><li>Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+mechanistic+separation+of+cross-presentation+and+endogenous+antigen+presentation.">Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation.</a> Nature. 9, 558-566 (2008).</li><li>Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+lymphocyte+proliferation:+CFSE+kills+dividing+cells+and+modulates+expression+of+activation+markers.">Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers.</a> Cellular immunology. , 79-85 (2009).</li><li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+CD8(+)+antigen-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+after+enrichment+based+on+cytokine+secretion:+comparison+with+the+MHC-tetramer+technology.">Functional characterization of CD8(+) antigen-specific cytotoxic T lymphocytes after enrichment based on cytokine secretion: comparison with the MHC-tetramer technology.</a> Scand J Immunol. 52, 544-549 (2000).</li><li>Wang, W., Golding, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytotoxic+T+lymphocyte+response+against+a+protein+antigen+does+not+decrease+the+antibody+response+to+that+antigen+although+antigen-pulsed+B+cells+can+be+targets.">The cytotoxic T lymphocyte response against a protein antigen does not decrease the antibody response to that antigen although antigen-pulsed B cells can be targets.</a> Immunology letters. 100, 195-201 (2005).</li><li>O'Sullivan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+CD8(+)+T+cells+use+cell-intrinsic+lipolysis+to+support+the+metabolic+programming+necessary+for+development.">Memory CD8(+) T cells use cell-intrinsic lipolysis to support the metabolic programming necessary for development.</a> Immunity. 41, 75-88 (2014).</li><li>Xu, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+interferon+protects+antiviral+CD8++T+cells+from+NK+cell+cytotoxicity.">Type I interferon protects antiviral CD8+ T cells from NK cell cytotoxicity.</a> Immunity. 40, 949-960 (2014).</li><li>Volk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+humanized+mouse+models+for+adoptive+T+cell+transfer.">Comparison of three humanized mouse models for adoptive T cell transfer.</a> The journal of gene medicine. 14, 540-548 (2012).</li><li>Safinia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+Mice+as+Preclinical+Models+in+Transplantation.">Humanized Mice as Preclinical Models in Transplantation.</a> Methods Mol Biol. 1371, 177-196 (2016).</li><li>Grover, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+NOG+mice+as+a+model+for+tuberculosis+vaccine-induced+immunity:+a+comparative+analysis+with+the+mouse+and+guinea+pig+models+of+tuberculosis.">Humanized NOG mice as a model for tuberculosis vaccine-induced immunity: a comparative analysis with the mouse and guinea pig models of tuberculosis.</a> Immunology. 152, 150-162 (2017).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Современные вакцины являются идеально composedof очищенный антигена и адъювантов, с возможным добавлением системы доставки как липосомы, вирусоподобных частиц, наночастицы или живой векторов. Ключевым аспектом при разработке вакцины необходимо выбрать правильный адъювантной согласно кл...

Цитотоксических лимфоцитов T (CTL), вызывая вакцины являются ключевыми терапевтических вмешательств, которые были разработаны для борьбы с определенных видов рака1. CTL также важны для профилактической вакцины против внутриклеточных возбудителей2. Кроме того CTL являются одним из немногих механизмов иммунной обороны, функционально активных популяции риска таких новорожденных3,4 , которых также зависят от CTL борьбы с ранней жизни инфекции5. В этой связи вакцин против респираторных-синцитиальный вирус (RSV), которые были разработаны с адъювантом, которые не вызывают CTL ответы (квасцы) привели к полным провалом вакцины, ведущих к серьезным осложнениям после инфекции у младенцев6. Эти негативные эффекты вакцинации могут быть отменены CD8+ Т-клеток ответ7. Ранее мы показали, что основные цитокинов (тип и интерферонов) вызвало некоторые стимулятором интерферона генов (Стинг) агонистами важны для CTL ответы, порожденных эти адъюванты8, в частности путем измерения распространения OT-я T-клеток после вакцинации и использования этих результатов как мера CTL, вызывая возможности наблюдается в расширенной вакцинации расписания9. Измерение количества OT-я CD8+ T-клеток в дикого типа (WT) C57BL/6 получателей мыши Карбоксифлуоресцеина succinimidyl эфира (CFSE) краситель разрежения является надежной оценки возможности адъювантной вакцины для создания кросс грунт SIINFEKL, (иммуно доминантный пептид овальбумина, OVA). Вариации этой техники широко используются для оценки распространения OT-я CD8+ и OT-II CD4+ T клетки. Например он был использован в отсутствие отдельных цитокинов (KO мышей) или измерить эффективность вакцины после отзыва антигена в WT животных. Мы разработали короткой протокола (4 дня эксперимент) в котором после пассивной передачи CFSE-витражи OT-я CD8 клетки+ T, подкожной иммунизации (с.к.), состоящий из одной дозе 50 мкг бесплатно эндотоксина OVA, дополнена тест адъювантов осуществляется (Рис. 1). Следить за 48 ч после вакцинации результатов обеспечивает надежное доказательство адъювантной способность генерировать CTL ответов. В этой стратегии можно оценить потенции локального иммунного ответа в Дренажный лимфатический узел после иммунизации, а также степени реакции путем измерения активности CTL селезенки (или отдаленных лимфатических узлов).

<table><tbody><tr><td>BD LSR Fortessa Cell Analyzer</td><td>BD</td><td>Special Order</td><td>Flow Cytometer</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Molecular Probes</td><td>C34554</td><td>Proliferation Dye</td></tr><tr><td>MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit</td><td>Biolegend</td><td>480007</td><td>Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells.</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td><td>Molecular Probes</td><td>L23105</td><td>Dead Cell Marker</td></tr><tr><td>CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-0900-82</td><td>antibody</td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD8a Antibody</td><td>BioLegend</td><td>100712</td><td>antibody</td></tr><tr><td>BV421 Rat Anti-Mouse CD4</td><td>BD</td><td>740007</td><td>antibody</td></tr><tr><td>Z2 coulter Particle count and Size Analyzer</td><td>Beckman Coulter</td><td>9914591DA</td><td>Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter</td></tr><tr><td>EndoGrade Ovalbumin (10 mg)</td><td>Hyglos(Germany)</td><td>321000</td><td>Ovalbumin endotoxin free tested.</td></tr><tr><td>Cell Strainer 100&amp;micro;m nylon</td><td>Corning</td><td>352360</td><td>Cell strainer (100 &amp;micro;m pore mesh cups).</td></tr><tr><td>Sample Vials</td><td>Beckman Coulter</td><td>899366014</td><td>Sample vials for Z2 automated counter</td></tr><tr><td>C57BL/6 mice (CD90.2)</td><td>Harlan (Rossdorf, Germany)</td><td></td><td>Company is now Envigo</td></tr><tr><td>OT-I (C57BL/6 background, CD90.1)</td><td>Harlan (Rossdorf, Germany)</td><td></td><td>Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo</td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>Fischer (Corning)</td><td>14-959-5</td><td>Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL tubes</td><td>Fischer (Corning)</td><td>05-527-90</td><td>Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td></tr><tr><td>PBS (500 mL)</td><td>Fischer (Gibco)</td><td>20-012-027</td><td>Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2</td></tr><tr><td>Red lamp (heating lamp)</td><td>Dirk Rossmann GmbH (Germany)</td><td>405096</td><td>Heating infrred lamp (100 wats)</td></tr><tr><td>IsoFlo (Isoflurane)</td><td>Abbott Laboratories (USA)</td><td>5260.04-05.</td><td>Isoflurane anesthesic (250 mL flask).</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber&lt;/strong&gt;</td><td>Parkland Scientific</td><td>V3000PK</td><td>Isoflurane anesthesia machine.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td><td>11-875-093</td><td>Base medium with Glutamine (500 mL)</td></tr><tr><td>Pen-Strept antibiotic solution (Gibco)</td><td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td><td>15-140-148</td><td>Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td></tr><tr><td>Fetal Bobine Serum (Gibco)</td><td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td><td>10082147</td><td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer (100 ml)</td><td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td><td>A1049201</td><td>Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also</td></tr><tr><td>Plastic Petri Dishes</td><td>Nunc (distributed by ThermoFischer)</td><td>150340</td><td>60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated</td></tr><tr><td>Cell Clump Filter</td><td>CellTrics (Sysmex)</td><td>04-004-2317</td><td>CellTrics&amp;reg; 50 &amp;mu;m, sterile</td></tr></tbody></table>

rapid in vivo assessment of adjuvant's cytotoxic t lymphocytes generation capabilities for vaccine development

Оценка современных подразделение вакцин показывает, что поколения нейтрализующих антител является важным, но не достаточным для отбора адъювантной. Поэтому срочно необходимы адъювантов гуморальные и клеточные иммуно стимулирующее возможности, которые способны содействовать цитотоксических Т лимфоцитов (CTL) ответы. Таким образом верных мониторинг адъювантной кандидатов, которые вызвать кросс грунтовки и впоследствии повышения CTL поколения представляет решающим шагом в разработке вакцин. Здесь мы представляем заявку для метода, который использует SIINFEKL-конкретных (OT-я) Т-клеток следить в кросс Презентация модели антигена овальбумина (OVA) в естественных условиях при наличии различных адъювантной кандидатов. Этот метод представляет собой быстрый тест для выбора адъювантов с лучшими возможностями кросс грунт. С распространением CD8+ T клетки является наиболее ценным признаком кросс грунтовки и он также рассматривается как коррелят адъювант индуцированной кросс-презентации. Эта функция может быть оценен в различных иммунных органов как лимфатических узлах и селезенке. Степени CTL поколения может также контролироваться, тем самым давая информацию о характере местной (главным образом дренаж лимфатических узлов) или системного реагирования (отдаленных лимфатических узлов и селезенки). Этот метод также позволяет несколько модификаций для тестирования препаратов, которые могут препятствовать конкретные пути кросс презентация и также предоставляет возможность для использования в различных штаммов обычных и генетически измененных мышей. Таким образом приложение, которое мы представляем здесь будет полезным для лабораторий вакцины в промышленности и научных кругов, которые разрабатывать или изменять химические адъювантов для исследований и разработок вакцин.

Чтобы протестировать лечения, используя различные комбинации адъювантов (ADJ1 и ADJ2), мы оценили CTL генерирующих мощностей путем измерения распространения восприимчивую передаваемых OT-я CD8 клетки+ T подачей cytometry (рис. 2). Для этого мы ранее окрашенных ...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development at JoVE.com

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

Мы представляем здесь заявку на стандартный иммунологический метод (CFSE окрашенных OT-я распространения) предназначен для быстро отслеживать адъювант опосредованных цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) поколения в vivo. Этот быстрый оценки возможностей CTL полезен для разработки профилактических вакцин против внутриклеточных возбудителей, а также терапевтического рака вакцины.

Быстрое в естественных условиях оценки адъювант в цитотоксических T лимфоциты поколение возможностей для разработки вакцин

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. ...

rapid-vivo-assessment-adjuvant-s-cytotoxic-t-lymphocytes-generation

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

8.6K Views.  Helmholtz Centre for Infection Research. Мы представляем здесь заявку на стандартный иммунологический метод (CFSE окрашенных OT-я распространения) предназначен для быстро отслеживать адъювант опосредованных цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) поколения в vivo. Этот быстрый оценки возможностей CTL пол?...

Video: Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

Анализ in vitro для оценки влияния иммунорегуляторных Пути на ВИЧ-специфических CD4 Т-клеток эффекторной функцией

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Immunology and Infection

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

Использование флуоресцентных целевых массивов для оценки Т-клеточные ответы<em&gt; В естественных условиях</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Всего животного визуализации и проточной цитометрии методы анализа антиген-специфических CD8 + Т-клеточные ответы после вакцинации наночастиц

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

В естественных условиях Assay для обнаружения антиген специфические Т-лимфоцитов цитолитического функции с помощью вакцинации модели

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we investigated immunological effects of a novel lipid-DNA immunostimulant in nanoparticle form from different administration routes in the mouse: oral, intranasal, subcutaneous, footpad, intraperitoneal, and intravenous. These injections will directly influence the immune response, and harvesting lymphatic tissues and analysis of dendritic cell (DC) activation in the tissues are crucial parts of these evaluations. The extraction of mediastinal lymph nodes (mLNs) is important but quite complex because of the size and location of this organ. A stepwise procedure for harvesting the inguinal lymph node (iLN), mLN, and spleen and analyzing DC activation by flow cytometry is described.

Experimental procedures for the subsequent extraction of lymphatic tissues to test lymphoid dendritic cell activation are described after treatment of an immunostimulating nanomaterial.

Иммуностимулирующее агент оценки: Лимфоидной ткани добычи и инъекций маршрут зависимых дендритные клетки активации

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

Портняжное в естественных условиях цитотоксичности исследования для изучения Иммунодоминирования в опухоль конкретных CD8+ т ячейки ответы

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

Epitope peptides have attracted widespread attention in the field of tumor vaccines because of their safety, high specificity, and convenient production; in particular, some MHC I-restricted epitopes can induce effective cytotoxic T lymphocyte activity to clear tumor cells. Additionally, nasal administration is an effective and safe delivery technique for tumor vaccines due to its convenience and improved patient compliance. However, epitope peptides are unsuitable for nasal delivery because of their poor immunogenicity and lack of delivery efficiency. Nanoemulsions (NEs) are thermodynamically stable systems that can be loaded with antigens and delivered directly to the nasal mucosal surface. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) is the core pentapeptide of laminin, an integrin-binding peptide expressed by human respiratory epithelial cells. In this study, an intranasal self-assembled epitope peptide NE tumor vaccine containing the synthetic peptide IKVAV-OVA257-264 (I-OVA) was prepared by a low-energy emulsification method. The combination of IKVAV and OVA257-264 can enhance antigen uptake by nasal mucosal epithelial cells. Here, we establish a protocol to study the physicochemical characteristics by transmission electron microscopy (TEM), atomic force microscopy (AFM), and dynamic light scattering (DLS); stability in the presence of mucin protein; toxicity by examining the cell viability of BEAS-2B cells and the nasal and lung tissues of C57BL/6 mice; cellular uptake by confocal laser scanning microscopy (CLSM); release profiles by imaging small animals in vivo; and the protective and therapeutic effect of the vaccine by using an E.G7 tumor-bearing model. We anticipate that the protocol will provide technical and theoretical clues for the future development of novel T cell epitope peptide mucosal vaccines.

Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

Here, we present detailed methods for the preparation and evaluation of the nasal self-assembled nanoemulsion tumor vaccine in vitro and in vivo.

Препарат, характеристики, токсичность и оценка эффективности назальной самоорганизующейся наноэмульсионной противоопухолевой вакцины in vitro и in vivo

Epitope peptides have attracted widespread attention in the field of tumor vaccines because of their safety, high specificity, and convenient production; ...

In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D

As a principal ingredient of vaccines, adjuvants can directly induce or enhance the powerful, widespread, innate, and adaptive immune responses associated with antigens. Ophiopogonin D (OP-D), a purified component extracted from the plant Ophiopogon japonicus, has been found to be useful as a vaccine adjuvant. The problems of the low solubility and toxicity of OP-D can be effectively overcome by using a low-energy emulsification method to prepare nanoemulsion ophiopogonin D (NOD). In this article, a series of in vitro protocols for cellular activity evaluation are examined. The cytotoxic effects of L929 were determined using a cell counting kit-8 assay. Then, the secreted cytokine levels and corresponding immune cell numbers after the stimulation and culture of splenocytes from immunized mice were detected by ELISA and ELISpot methods. In addition, the antigen uptake ability in bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs), which were isolated from C57BL/6 mice and matured after incubation with GM-CSF plus IL-4, was observed by laser scanning confocal microscopy (CLSM). Importantly, macrophage activation was confirmed by measuring the levels of IL-1&#946;, IL-6, and tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) cytokines by ELISA kits after coculturing peritoneal macrophages (PMs) from blank mice with the adjuvant for 24 h. It is hoped that this protocol will provide other researchers with direct and effective experimental approaches to evaluate the cellular response efficacies of novel vaccine adjuvants.

In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D

The protocol presents detailed methods for evaluating whether the nanoemulsion ophiopogonin D adjuvant promotes effective cellular immune responses.

В пробирке Оценка клеточной активности наноэмульсионной вакцины Адъювант офиопогонин D

As a principal ingredient of vaccines, adjuvants can directly induce or enhance the powerful, widespread, innate, and adaptive immune responses associated ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and play a unique role within the immune system by linking the innate and adaptive immune responses. These cells can phagocytize and then present captured antigens to effector immune cells, triggering a diverse range of immune responses. This paper demonstrates a standardized method for the in vitro generation of bovine monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) isolated from cattle peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and their application in evaluating vaccine immunogenicity.
Magnetic-based cell sorting was used to isolate CD14+ monocytes from PBMCs, and the supplementation of complete culture medium with interleukin (IL)-4 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) was used to induce the differentiation of CD14+ monocytes into naive MoDCs. The generation of immature MoDCs was confirmed by detecting the expression of major histocompatibility complex II (MHC II), CD86, and CD40 cell surface markers. A commercially available rabies vaccine was used to pulse the immature MoDCs, which were subsequently co-cultured with naive lymphocytes.
The flow cytometry analysis of the antigen-pulsed MoDCs and lymphocyte co-culture revealed the stimulation of T lymphocyte proliferation through the expression of Ki-67, CD25, CD4, and CD8 markers. The analysis of the mRNA expression of IFN-&#947; and Ki-67, using quantitative PCR, showed that the MoDCs could induce the antigen-specific priming of lymphocytes in this in vitro co-culture system. Furthermore, IFN-&#947; secretion assessed using ELISA showed a significantly higher titer (**p &#60; 0.01) in the rabies vaccine-pulsed MoDC-lymphocyte co-culture than in the non-antigen-pulsed MoDC-lymphocyte co-culture. These results show the validity of this in vitro MoDC assay to measure vaccine immunogenicity, meaning this assay can be used to identify potential vaccine candidates for cattle before proceeding with in vivo trials, as well as in vaccine immunogenicity assessments of commercial vaccines.

The methodology describes the generation of bovine monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) and their application for the in vitro evaluation of antigenic candidates during the development of potential veterinary vaccines in cattle.

Определение иммуногенности вакцины с использованием дендритных клеток, полученных из моноцитов крупного рогатого скота

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...

An Immunological Technique to Monitor Adjuvant-Mediated Cytotoxic T Lymphocyte Generation

Source: Lirussi, D. et al., <a href="https://app.jove.com/v/57401">Rapid In Vivo&#160;Assessment of Adjuvant&#39;s Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The video demonstrates an immunological method to monitor in vivo adjuvant-induced cytotoxic T lymphocyte or CTL production. A mouse is pre-injected with genetically engineered, proliferative dye-stained donor CD8+ T lymphocytes. Subcutaneous injection of ovalbumin with adjuvants generates cytotoxic CD8+ T lymphocytes that are identified post-harvesting through immunostaining and flow cytometry.

Иммунологическая методика мониторинга адъювант-опосредованной генерации цитотоксических Т-лимфоцитов

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
All mice ...

Быстрое в естественных условиях оценки адъювант в цитотоксических T лимфоциты поколение возможностей для разработки вакцин

Резюме

Смотреть дополнительные видео

PLAYLIST