Name: methods for the study of regeneration in stentor
Uploaded: 2018-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Study of Regeneration in Stentor at JoVE.com

Эта работа была поддержана гранта NIH R01 GM113602 (WFM) и NSF 1144247 (AL). Мы признаем, Марк Slabodnick и Натали Киркленд для разработки первоначальных версий некоторых из этих протоколов и информативные дискуссии. Мы благодарим Карина Perlaza и Грейсон Льюис для критических чтении рукописи.

<ol>
	<li>Kirschner, M., Gerhart, J., Mitchison, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+"vitalism".">Molecular "vitalism".</a> Cell. 100 (1), 79-88 (2000).</li><li>Shulman, J. M., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+single+cells.">Pattern formation in single cells.</a> Trends in Cell Biology. 9 (12), M60-M64 (1999).</li><li>Wloga, D., Frankel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+molecules+to+morphology:+cellular+organization+of+Tetrahymena+thermophila.">From molecules to morphology: cellular organization of Tetrahymena thermophila.</a> Methods in Cell Biology. 109, 83-140 (2012).</li><li>Frankel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pattern Formation: Ciliate Studies and Models. , (1989).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+experiments+concerning+primordium+formation+in+Stentor+coeruleus.">Grafting experiments concerning primordium formation in Stentor coeruleus.</a> Journal of Experimental Zoology Part A. 131 (1), 75-121 (1956).</li><li>Lillie, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+smallest+parts+of+Stentor+capable+of+regeneration;+a+contribution+on+the+limits+of+divisibility+of+living+matter.">On the smallest parts of Stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter.</a> Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+proportionate+structures+in+Stentor.">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macronuclear+genome+of+Stentor+coeruleus+reveals+tiny+introns+in+a+giant+cell.">The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell.</a> Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).</li><li>Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-repairing+cells:+How+single+cells+heal+membrane+ruptures+and+restore+lost+structures.">Self-repairing cells: How single cells heal membrane ruptures and restore lost structures.</a> Science. 356 (6342), 1022-1025 (2017).</li><li>Slabodnick, M., Prevo, B., Gross, P., Sheung, J., Marshall, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cytoplasmic+flow+during+single-cell+wound+healing+in+Stentor+coeruleus.">Visualizing cytoplasmic flow during single-cell wound healing in Stentor coeruleus.</a> Journal of Visualized Experiments. 82 (82), 50848 (2013).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Stentor. , (1961).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinase+regulator+mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+stentor+morphogenesis.">The kinase regulator mob1 acts as a patterning protein for stentor morphogenesis.</a> PLOS Biology. 12 (5), e1001861 (2014).</li><li>Harris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Chlamydomonas sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. 1, (2009).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Культивирование Stentor представляет ряд проблем. Во-первых выполнять эксперименты, которые требуют большое количество клеток, необходимо поддерживать большое количество Stentor культур, как культуры, стать нездоровым, когда Stentor концентрация превышает 20 клеток/мл. Во-вторых организмов, которые могут загрязнять Stentor культур часто делят быстрее, чем "Стентор" и подавить культуры (общие загрязнителем является коловраток). Таким образом необходимо периодически проверяйте культуры под микроскопом и удаления загрязнений. Иногда новой культуры необходимо начинать с небольшого числа вручную спасены от загрязненных культуры клеток. Это увеличивает время, необходимое для поддержания здорового Stentor культур. В-третьих расширение одну ячейку в 400 мл культуры требует по крайней мере один месяц, поскольку Stentor клеточный цикл составляет 3-5 дней. В-четвертых в отличие от других моделей инфузории, Stentor редко идут в форму кисты, и они не могут быть заморожены.
Важным аспектом культивирования Stentor является выбор соответствующего питания организма. Ранее были описаны различные методы для культивирования "Стентор" . Один из них предлагает использовать обезжиренного молока культуры бактерий, которые затем кормить "Стентор". Такой метод эффективен при культивировании Stentor; Однако применение геномных технологий требует чистой образцов, чтобы избежать путаницы в результате геномной считывает из неопределенного пищи организмов. С помощью текущего протокола, Stentor может быть выращен в массы и, потому что последовательными их питание, Хламидомонада, присутствие геномной загрязнения из организма пищи можно обнаружить и контролируемых для. По неизвестным причинам татарским пришлось пополнить его запасы, вернувшись к где он нашел Stentor раньше. С нынешним протоколом мы были в состоянии держать Stentor лет.
Регенерация эксперименты с Stentor как правило просты, но есть несколько критических деталей, чтобы иметь в виду. Что касается раздела 2, резка Stentor клетки в половине может быть освоен в минутах. Мастеринг расширенные процедуры микрохирургии Stentor может потребоваться неделя практики. Во время выполнения мочевина или сахароза лечения (раздел 3), если в начале изображения Большинство клеток до сих пор их membranellar полос, увеличить время инкубации на 10-30 s для когда сахарозы лечение проводится следующая. Не увеличивают время лечения сахарозы за 3 мин инкубации, потому что это приведет к гибели клеток.
Визуализационная диагностика Stentor регенерации требует методов изображения большие клетки более длительных периодов времени. Метод обработки изображений, подробно изложены в разделе 4 может использоваться только с вертикально микроскопа. Если вместо этого доступен инвертированным микроскопом, клетки размещаются на слайд или coverslip в небольших камерах. Одним из способов является создание камеры из вазелина и крышка с другой coverslip для предотвращения испарения. Кроме того, можно сделать камеру для отдельной ячейки, сделав отверстие с Дырокол желаемого размера 1 x 1 см2 площади крепежного элемента кремния (таблица материалов), размещение прокладку на coverslip, положив клетки в камере и охватывающих в палату с другой coverslip. При визуализации, если не в правильной ориентации наблюдать характерные особенности каждого этапа регенерации Stentor , коснитесь плиты прочно для того, чтобы сделать ячейку контракта. Смотреть продлить для идентификации этапа регенерации клеток (полное расширение занимает около 45 s). Если ячейка находится все еще в неправильно ориентации, повторите нажатие. Изображения, показано на рисунке 1 и на рисунке 6 были приняты микроскопом стерео зум; Однако все подробно может быть эксперименты с использованием 5 X рассекает стерео Микроскоп.
Еще одна проблема, помимо культивирования и визуализации Stentor является отслеживание регенерации, в частности количество времени, необходимого для определения этапов. Если регенерации клеток прекрасно ориентируется с регионом устные зачаток ясно видны, идентификации этапа занимает несколько секунд. Иногда однако, Stentor ячейка находится в предотвращение четкое назначение этапа регенерации, таким образом принимая больше времени для определения ориентации. Значительное количество времени, необходимого для стадии отдельных регенерации клеток может задержать количественной оценки всех регенерации клеток, тем самым уменьшая временной точность постановки и требующих наблюдателя ждать и повторно изображения клетки после этого переехал Новая ориентация. Следовательно этот эксперимент является трудоемким и время. По этим причинам было бы весьма желательно разработать автоматизированные методы для обнаружения Stentor клетки и назначение этапы регенерации в данных видео микроскопии. Это также позволит более воспроизводимость экспериментов, увеличивается размер выборки и удаления человека предвзятости.
Появление высокочувствительный геномных и протеомических методами начал положить исследований единичных клеток в досягаемости. Для такого анализа одноклеточных гигантский размер ячейки Stentor делает желательным испытуемого для доказательства в концепция экспериментов. Для таких экспериментов можно культивирование Stentor является основополагающим, и так описанные здесь методы должны играть роль в дальнейшем развитии более передовых методов одной ячейки.

Клетки не являются простые сумки ферментов, но довольно сложных машин, чьи компоненты тщательно масштабируется до нужного размера и расположены в четко определенных позициях. Морфогенез отдельных клеток представляет собой ключевой процесс в клетке и биологии развития, но ее молекулярный механизм неизвестных1,2. В то время как некоторые клетки культивировали напоминают капли, одноклеточные организмы может иметь чрезвычайно сложную архитектуры, подтверждается комплекс корковых структур, видели в инфузории3,4.
Наиболее extreme пример высокоструктурированных ячейки пожалуй Stentor пятно, гигантских heterotrichous ресничастая отдаленно связанные с Tetrahymena и Парамеции. Стентор является длиной 1 мм и покрыт с более чем 100 продольными полосами синего пигмента, чередующихся с рядами ресничек, организованный Параллельные стеки микротрубочек лент, которые работают длина всей ячейки. Ячейка является воронкообразные (рис. 1), с membranellar полосами и устные аппарат (OA) на передний конец и holdfast, которое придает ячейки подложки на своем заднем конце. В дополнение к ясно передней задней полярности клетки также показывает отличительные хиральная патронирования, таким образом, что расстояние между рядами цилиарной постепенно увеличивается в направлении по часовой стрелке. Это приводит к сплошности, где узкие строка отвечает максимально строку и этот регион клеточной поверхности, известный как Локус полосой контраст, может вызывать образование второго набора структур переднего конца когда привитым другой ячейки5, делая это формально эквивалентно Шпеман Организатор. Таким образом, все основные процессы развития биологии у их аналогов в Stentor: axiation, модель формирования и индукции. В эмбрион эти процессы управляются судьба различия между различными ячейками, но в Stentor, они должны определяться судьбой различия между различными регионами в одной ячейке. Что определяет различия между регионами в рамках Stentor является тайной.
Если отрезать любой частью Stentor , Пропавшая часть клетки могут регенерировать приносить нормальной клетки в течение нескольких часов. Если ячейка разрезать пополам, или даже на гораздо меньшие куски, каждый кусок реорганизуются в ячейку нормальный перспективных, но меньше и восстанавливает надлежащей пропорциональности между клеток частей6,7. Даже мелкие фрагменты, 1/64й размер оригинального ячейки, способны восстанавливаться в небольшой, но обычно пропорции ячейку, а затем растут в полный размер6. Стентор таким образом представляет уникальную возможность для изучения механизмов органеллы размер масштабирование и клеток роста регулирования с использованием хирургические методы, которые обычно применяются на уровне тканей или всей организмов.
Одним из свойств Stentor , что позволяет ей восстанавливаться от широкий спектр хирургических операций является, что он содержит один nodulated одной (рис. 1) с около 50 000 копий всего генома8. До тех пор, как клетки фрагмент содержит по крайней мере один macronuclear узел, он имеет возможность полностью восстановить. Другое свойство лежащие в основе способности регенерации Stentorявляется ее удивительные способности заживления раны. Хотя многие типы клеток способны исцеление их раны9, Stentor возможность оправиться от чрезвычайной спектр физического возмущения. Пример восстановления Stentor от резкого возмущений, вместе с методами для визуализации цитоплазматических потока в Stentor10 ранее сообщалось. Эти методы позволяют исследования как ранение и последующей регенерации влияют на физическое состояние цитоплазме.
Огромный размер stentor, способность Чрезвычайный регенерации и тот факт, что она проявляется многие из развития явлений, видели в многоклеточные зародыши (например, организаторы, axiation и кучность) привлекла многие биологи развития во время к концу прошлого века, в том числе Томас Хант Морган7. В течение 50 и 60 подходы в микрохирургии продемонстрировали поразительное спектр восстановительных и морфогенетических процессов в этом одиночный celled организм11. Однако как система модель молекулярной биологии лишь недавно был разработан Stentor . В течение последних нескольких лет геном Stentor был секвенирован и собрал8, и способ возмущают экспрессии генов с помощью РНК-интерференции, кормления был развитых12.
Одна из причин, что Stentor был разработан модельный организм для современной молекулярной биологии только недавно был сложности выращивания больших культур из-за его длительного клеточного цикла (от 3 до 5 дней). Однако современные геномных и proteomic методы требуют меньше материала, чем они привыкли, и объем одной ячейки Stentor достаточна для этих методов, даже не прибегая к сверхчувствительная методы, которые были разработаны для анализа сингл клетки, которые намного меньше, чем "Стентор". Статья 1 протокола подробно процедура создания большой культуры из одной клетки "Стентор" . Такой же подход может использоваться для создания большой культуры из фрагмента клеток, полученные путем разрезания ячейки. Раздел 1 также обеспечивает руководящие принципы для поддержания здорового Stentor культур более длительных периодов времени. Статья 2 протокола предоставляет методологию для стимулирования регенерации клеток путем разрезания клетки вручную с помощью иглы, стекла. Статья 3 протокола посвящена двух методов стимулирования регенерации конкретных клеточных структур (membranellar группы и устных аппарат): лечение клетки с мочевина или сахароза приводит к пролить эти структуры, следуют их Регенерация. Статья 4 протокола подробно метод для визуализации отдельных регенерации клеток более длительных периодов времени. Раздел 4 заканчивается с описанием на этапах регенерации и советы на анализ динамики регенерации.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Stentor coeruleus&lt;/em&gt; live culture</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>131598</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Chlamydomonas&lt;/em&gt; &lt;em&gt;reinhardtii&lt;/em&gt; on agar</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>152040</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurized springwater, 1-quart bottle</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>132458</td><td></td></tr><tr><td>Methyl cellulose, 1500 cP</td><td>Millipore Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex glass spot plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>13748B</td><td></td></tr><tr><td>Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>715740</td><td></td></tr><tr><td>2-cup glass container with glass lid</td><td>Pyrex</td><td>1095600</td><td></td></tr><tr><td>CultureWell silicone sheet material</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Fisher finest</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>TAP Growth Media, optimized for &lt;em&gt;Chlamydomonas&lt;/em&gt; culture</td><td>ThermoFisher</td><td>A1379801</td><td></td></tr><tr><td>Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Petrolatum, Petroleum Jelly, White</td><td>Spectrum</td><td>P1037</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary tubes.&lt;br/&gt; OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm.</td><td>Sutter Instrument</td><td>B120-90-10</td><td></td></tr><tr><td>Needle puller P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000 stereo microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiozoom V16, stereo zoom microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methods for the study of regeneration in stentor

Клетки нуждаются в том иметь возможность восстановить их частей, чтобы оправиться от внешних возмущений. Одноклеточные ресничастая Stentor пятно это отличная модель организма учиться заживление и регенерацию клеток последующих. Геном Stentor стали доступны недавно, наряду с современной молекулярной биологии методы, такие как RNAi. Эти инструменты позволяют изучить сингл клеточной регенерации на молекулярном уровне. В первом разделе протокола охватывает создание Stentor клеточных культур от единичных клеток или фрагменты клеток, а также общие руководящие принципы для поддержания Stentor культур. Культивирование Stentor в больших количествах позволяет использовать ценные инструменты, как биохимия, последовательности и масс-спектрометрии. В последующих разделах протокола охватывают различные подходы для стимулирования регенерации в "Стентор". Вручную резки клетки с иглой стекла позволяет изучать регенерации клеток больших частей, в то время как лечение клетки с мочевина или сахароза позволяет изучать регенерации конкретных структур, расположенных в передней конце ячейки. Предоставляется метод для визуализации отдельных регенерации клеток, а также Рубрика для постановки и анализа динамики регенерации. Весь процесс восстановления разделен на три этапа. Посредством визуализации динамики популяции клеток через этапы прогрессирования, свидетельствует неоднородность времени регенерации.

Стентор культур были надежно установлены и поддерживаются с отдельными ячейками или фрагменты клеток, используя раздел 1 протокола. Представитель пример большой здоровой культуры показан на видео 1.
Ход времени регенерации была измерена в Stentor , с помощью метода лечения сахарозы для инициирования регенерации, описанные в шаг 3.1, в сочетании с изображений и метода анализа, обсуждаются в разделе 4 (рис. 7). Этот участок указывает, что существует один час долго распространение в времени, занятого населения клеток для достижения любой конкретной стадии. Этот тип анализа позволяет исследование временной гетерогенности в процессе регенерации в популяции регенерации клеток.
Ниже приводится краткая информация о времени регенерации, что до настоящего времени наблюдается после десятки сахарозы лечения (рис. 4 и рис. 6). Этап 1 — когда Stentor клетки выглядят как слезы без каких-либо membranellar группы (этот этап начинается сразу же после вымывания сахарозы). Этот этап длится 3-6 ч. 2 этап, когда группа membranellar появляется и растет (3-6 ч после лечения сахарозы). Этот этап длится 3-4 ч. 3 стадии, когда устные зачаток появляется в конце заднего membranellar группы (6-8 ч после лечения сахарозы), и обе структуры двинулась к переднего конца ячейки. Этот этап длится 1-2 ч. Когда группа membranellar и устные аппарат достиг переднего конца ячейки, это указано завершение регенерации. Ячейка принял характерная Stentor труба как форма. Клетки были полностью восстановленный 8-9 ч после лечения сахарозы.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig1.jpg"> Рисунок 1. Снимок Stentor. Группа membranellar и устные аппарата указаны на передней конца ячейки. Holdfast находится в заднем конце ячейки. Стентор одной — nodulated. Сытый Stentor имеет зеленый пищи вакуолей, содержащие главным образом Хламидомонада. Линейки-0.5 мм. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig1large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig2.jpg"> Рисунок 2. Установка резки Stentor . Клетки резка выполняется вручную манипулируя Стеклянный иглу глядя на ячейку с помощью коммерчески доступных рассечения стерео Микроскоп. Папиросной бумаги призван обеспечить на белом фоне, чтобы увидеть клетки лучше. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig3.jpg"> На рисунке 3. Снимки 3 Видео иллюстрирующие как сократить Stentor с стеклянной иглой. (A) A Stentor непосредственно перед игла коснется его. (B) A Stentor нежно сжал между иглой и стекла слайд. (C) A контракт Stentor реагировать силой иглы. (D) A Stentor сокращаются, осторожно нажав на ячейку с на стороне иглы. (E) A Stentor теперь пополам, но не разделены. (F) два Stentor фрагменты. Шкалы бар-0,25 мм. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig3large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2.jpg"> Рисунок 4. Схематическая визуализация раздела 3 и статьи 4 протокола. Это иллюстрированное протокол для выполнения сахарозы или мочевины лечение и наблюдение регенерации клеток. Время, указанное на нижней панели измеряется от начала мыть 1. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig5.jpg"> Рисунок 5. Установки для обработки изображений и/или прямого наблюдения регенерации с прямо микроскопом. В каждом 4 капли мкл висит от coverslip есть одна ячейка, прохождения регенерации. Воды в скважинах стеклянной пластины пятно ограничивает испарения капель. Эта установка позволяет после регенерации нескольких ячеек одновременно. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig6.jpg"> Рисунок 6. Снимки Stentor в каждом этапе группы membranellar и устные аппарат регенерации. (A) 1 этап характеризуется фигуру слезинки подобных клеток и отсутствие membranellar группы. (B) этап 2 характеризуется внешний вид группы membranellar, структура, основанная на реснички, которая бьет непрерывно. Membranellar полос, отмеченные белыми пунктирными линиями в панели B - д (C и D) этап 3 характеризуется внешний вид устного зачаток (отмечены стрелкой). Устные зачаток выглядит как invagination в конце заднего membranellar группы. Устные зачаток будет затем двигаться вверх к передней ячейки стать устные аппарат. Регенерации (E) завершена, когда ячейка принял характеристику Stentor труба как форма, и устные аппарат (отмечены стрелкой) увеличился на передней конца ячейки. Шкалы бар-0,25 мм. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig6large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig7.jpg"> Рисунок 7. Штабелироваться поле участка показаны как пропорции клеток во всех этапах регенерации после лечения сахарозы изменяет временем. Диаграмма показывает неоднородность в отношении сроков регенерации этапов в рамках населения регенерации клеток. «Обл. конец» указывает на завершение регенерации. Количество клеток: 28. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig7large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57759/57759video1.jpg"> Видео 1. Пример здоровой культуры Stentor . Как правило если культура – это концентрированный, рекомендуется разделять культуру. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video1.mp4" target="_blank">Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57759/57759video2.jpg"> Видео 2. Замедление Stentor с метилцеллюлоза. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video2.mov" target="_blank">Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/57759/57759video3.jpg"> Видео 3. Резка Stentor. Отдельные клетки могут быть вручную нарезать несколько под стерео, рассекает микроскопом, нажав Стеклянный иглу через ячейку. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video3.mov" target="_blank">Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Проблема с культурой</td>
			<td>Возможные средства правовой защиты</td>
			<td>Возможные предупреждения</td>
		</tr>
<tr>
<td>Культура является перегружены коловраток или других больших организмов.</td>
			<td>Удалите столько Stentor максимально в новой культуры блюдо. Затем промойте клетки три раза.</td>
			<td>Тщательно вымойте Stentor , получив их, даже при покупке их от коммерческого поставщика.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Культура поражены грибком или других мелких организмов.</td>
			<td>Определить угол где есть наименее Stentor. В этой области удалить столько средств массовой информации как можно скорее без удаления многих "Стентор" и добавить в новой PSW. Смесь осторожно, но тщательно distrubute вторжение организмы. Пропустить следующего кормления и Stentor будет есть их.</td>
			<td>Понаблюдать за культурой регулярно и удалить небольшие загрязнения путем обмена СМИ для свежих PSW.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Стентор возлагают друг на друга.</td>
			<td>Разбить культуры, что концентрация составляет менее 20 клеток/мл.</td>
			<td>Сплит культур чаще.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Стентор клетки спаривания.</td>
			<td>Кормите каждые 4 дня вместо каждые 5 дней.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Культура имеет много темных отходов материала.</td>
			<td>Удалите как можно больше темного материала, отходы Stentor , как можно не снимая клетки. Если Stentor привязаны к темный материал, Пипетка вверх и вниз, освободить Stentor клетки от их отходов и затем удалить СМИ с отходами без удаления клеток. Или удалить эти "Стентор" и кормить соответственно меньше.</td>
			<td>Корма Stentor 1 мл меньше пищи на 100 мл культуры.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Нездоровый вид (vacuolated/раздутые или округлые) Stentor.
</td>
			<td>Удалить столько средств массовой информации как можно скорее без удаления многих Stentor клетки и добавить новые PSW.</td>
			<td>Регулярно обмениваться средствами массовой информации.</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1. Руководство по устранению неполадок для культивирования "Стентор".

Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Study of Regeneration in Stentor at JoVE.com

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Методы для изучения регенерации в Stentor

Гигантские инфузории, пятно Stentor, система для изучения регенерации и заживление ран. Мы представляем процедуры для установления Stentor клеточных культур от единичных клеток или фрагменты клеток, вызывая регенерации клеток резки, химически стимулирования регенерации membranellar группы и устные аппарата, обработки изображений и анализа клеток Регенерация.

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

methods-for-the-study-of-regeneration-in-stentor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

11.7K Views.  University of California San Francisco. Гигантские инфузории, пятно Stentor, система для изучения регенерации и заживление ран. Мы представляем процедуры для установления Stentor клеточных культур от единичных клеток или фрагменты клеток, вызывая регенерации клеток резки, химически стимулиров?...

Video: Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

Использование Титон системы для изучения молекулярных механизмов регенерации данио рерио

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Наводить Complete полипа Регенерация от спинных Physa из Starlet актинии<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Despite the considerable progress made in the stent development in the last decades, cardiovascular diseases remain the main cause of death in western countries. Beside the benefits offered by the development of different drug-eluting stents, the coronary revascularization bears also the life-threatening risks of in-stent thrombosis and restenosis. Research on new therapeutic strategies is impaired by the lack of appropriate methods to study stent implantation and restenosis processes. Here, we describe a rapid and accessible procedure of stent implantation in mouse carotid artery, which offers the possibility to study in a convenient way the molecular mechanisms of vessel remodeling and the effects of different drug coatings.

A model of stent implantation in mouse carotid artery is described. Compared to other similar methods, this procedure is very rapid, simple and accessible, offering the possibility to study in a convenient way the vascular wall reaction to different drug-eluting stents and the molecular mechanisms of restenosis.

Мышиной модели имплантации стента в сонной артерии по изучению рестеноза

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Medicine

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings. 
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.

Here we present a protocol that is based on spinal cord slices cultured on multi-electrode arrays to study functional regeneration of propriospinal connections in vitro.

Исследуя функциональное Регенерация в Органотипической спинного мозга сопредседателей культур, выращенных на нескольких электродов массивов

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

Neuroscience

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian regeneration of any missing or damaged tissues is made possible by adult stem cells termed neoblasts3. Although these stem cells have been definitively shown to be pluripotent and singularly capable of reconstituting an entire animal4, the heterogeneity within the stem cell population and the dynamics of their cellular behaviors remain largely unresolved. Due to the large number and wide distribution of stem cells throughout the planarian body plan, advanced methods for manipulating subpopulations of stem cells for molecular and functional study in vivo are needed.
Tissue transplantation and partial irradiation are two methods by which a subpopulation of planarian stem cells can be isolated for further study. Each technique has distinct advantages. Tissue transplantation allows for the introduction of stem cells, into a na&iuml;ve host, that are either inherently genetically distinct or have been previously treated pharmacologically. Alternatively, partial irradiation allows for the isolation of stem cells within a host, juxtaposed to tissue devoid of stem cells, without the introduction of a wound or any breech in tissue integrity. Using these two methods, one can investigate the cell autonomous and non-autonomous factors that control stem cell functions, such as proliferation, differentiation, and migration.
Both tissue transplantation5,6 and partial irradiation7 have been used historically in defining many of the questions about planarian regeneration that remain under study today. However, these techniques have remained underused due to the laborious and inconsistent nature of previous methods. The protocols presented here represent a large step forward in decreasing the time and effort necessary to reproducibly generate large numbers of grafted or partially irradiated animals with efficacies approaching 100 percent. We cover the culture of large animals, immobilization, preparation for partial irradiation, tissue transplantation, and the optimization of animal recovery. Furthermore, the work described here demonstrates the first application of the partial irradiation method for use with the most widely studied planarian, Schmidtea mediterranea. Additionally, efficient tissue grafting in planaria opens the door for the functional testing of subpopulations of na&iuml;ve or treated stem cells in repopulation assays, which has long been the gold-standard method of assaying adult stem cell potential in mammals8. Broad adoption of these techniques will no doubt lead to a better understanding of the cellular behaviors of adult stem cells during tissue homeostasis and regeneration.

An effective method for grafting tissue of defined and consistent size between planaria is described. Also included is a description of how the immobilization technique used for transplantation can be adapted, in conjunction with lead shields, for the partial irradiation of live animals.

Планарии иммобилизации, частичное облучение, и тканей

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

Biology

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, repairing broken cell membrane before the cellular contents leak out. The giant unicellular organism Stentor coeruleus, in which cells can be more than one millimeter in size, have been a classical model organism for studying wound healing in single cells. Stentor cells can be cut in half without loss of viability, and can even be cut and grafted together. But this high tolerance to cutting raises the question of why the cytoplasm does not simply flow out from the size of the cut. Here we present a method for cutting Stentor cells while simultaneously imaging the movement of cytoplasm in the vicinity of the cut at high spatial and temporal resolution. The key to our method is to use a &#34;double decker&#34; microscope configuration in which the surgery is performed under a dissecting microscope focused on a chamber that is simultaneously viewed from below at high resolution using an inverted microscope with a high NA lens. This setup allows a high level of control over the surgical procedure while still permitting high resolution tracking of cytoplasm.

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

The giant ciliate Stentor coeruleus is a classical system for studying regeneration and wound healing in single cells.&#160;By imaging Stentor cells simultaneously at low and high magnification it is possible to measure cytoplasmic flows before, during, and after wounding.

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Анализ на боковой линии регенерации в взрослых данио рерио

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

A Standardized Murine Model of Extracorporeal Shockwave Therapy Induced Soft Tissue Regeneration

Shockwave therapy (SWT) shows promising regenerative effects in several different tissues. However, the underlying molecular mechanisms are poorly understood. Angiogenesis, a process of new blood vessel formation is a leading driver of regeneration in softer tissues as well as a recently discovered effect of SWT. How the mechanical stimulus of SWT induces angiogenesis and regeneration and which pathways are involved is not fully understood. To further improve the clinical use of SWT and gain valuable information about how mechanical stimulation can affect tissue and tissue regeneration, a standardized model of SWT is needed. We, hereby, describe a standardized, easy to implement murine model of shockwave therapy induced regeneration, utilizing the hind-limb ischemia model.

This article describes a standardized murine model of tissue regeneration via shockwave treatment.

Shockwave therapy (SWT) shows promising regenerative effects in several different tissues. However, the underlying molecular mechanisms are poorly ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that has emerged as an essential model for regeneration studies. Little is known about how revascularization occurs in the context of regeneration in these animals. Here we report a simple method for visualization of the vasculature in axolotl via perfusion of 1,1&#8217;-Dioctadecy-3,3,3&#8217;,3&#8217;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). DiI is a lipophilic carbocyanine dye that inserts into the plasma membrane of endothelial cells instantaneously. Perfusion is done using a peristaltic pump such that DiI enters the circulation through the aorta. During perfusion, dye flows through the axolotl&#8217;s blood vessels and incorporates into the lipid bilayer of vascular endothelial cells upon contact. The perfusion procedure takes approximately one hour for an eight-inch axolotl. Immediately after perfusion with DiI, the axolotl can be visualized with a confocal fluorescent microscope. The DiI emits light in the red-orange range when excited with a green fluorescent filter. This DiI perfusion procedure can be used to visualize the vascular structure of axolotls or to demonstrate patterns of revascularization in regenerating tissues.

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Using a lipophilic 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) staining technique, Ambystoma mexicanum can undergo vascular perfusion to allow for easy visualization of the vasculature.

Перфузия DiI как метод сосудистой визуализации в<em&gt; Разное</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds of genes&#8212;many not associated with the oral apparatus (OA)&#8212;that are differentially regulated in phases throughout the regeneration process. It was hypothesized that this systemic reorganization and mobilization of cellular resources towards growth of a new OA will lead to observable changes in movement and behavior corresponding in time to the phases of differential gene expression. However, the morphological complexity of S. coeruleus necessitated the development of an assay to capture the statistics and timescale. A custom script was used to track cells in short videos, and statistics were compiled over a large population (N ~100). Upon loss of the OA, S. coeruleus initially loses the ability for directed motion; then starting at ~4 h, it exhibits a significant drop in speed until ~8 h. This assay provides a useful tool for the screening of motility phenotypes and can be adapted for the investigation of other organisms.

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

We present a protocol for the characterization of motility and behavior of a population of hundred micron- to millimeter-sized cells using brightfield microscopy and cell tracking. This assay reveals that Stentor coeruleus transitions through four behaviorally distinct phases when regenerating a lost oral apparatus.

Анализ паттернов подвижности стентора во время и после регенерации ротового аппарата с помощью отслеживания клеток

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds ...

Методы для изучения регенерации в Stentor

Резюме

Смотреть дополнительные видео

PLAYLIST