Мутантный библиотечный скрининг и транскриптомные исследования внутриклеточных патогенов могут помочь ответить на ключевые вопросы о геномной и нормативной адаптации патогенных микроорганизмов, представляющих интерес, которые используются для выживания внутри хозяина. Основными преимуществами этих методов являются то, что они являются крупномасштабными методами исследования, и что они обеспечивают объективное понимание адаптации к внутриклеточной жизни. Последствия этих методов распространяются на терапию mycobacterium abscessus, которые связывают с этим заболеванием, давая представление о потенциальных целей для вакцинной терапии.
Начните с культивирования амебы Acanthamoeba castellani, или Ac, в 30 миллилитров Пептоне Дрожжи Глюкоза среды в 75 квадратных сантиметров ткани культуры колбы при комнатной температуре. После одного часа используйте 25 миллилитров пипетки, чтобы удалить супернатант, и мыть клетки три раза с 10 миллилитров буфера Ac без углерода или азота на стирку. После последнего мытья, отсоединить амебу от нижней части колбы с одной энергичной встряхнуть, и настроить клетки в трубке Сокола, в пять раз от 10 до пяти амеб на мил концентрации в свежем буфере Ac.
Семя пять раз от 10 до четырех амеб на колодец в 96-хорошо пластины. Поместите пластину при 32 градусах по Цельсию в течение одного часа без тряски, чтобы плавающие амебы тропо-зоитов придерживаться скважин. Между тем, тепло бактерий на льду, и добавить пять микролитров талых бактерий к каждому хорошо в конце инкубации.
После 1,5 часов при 32 градусах по Цельсию, отбросьте супернатант, инвертировать пластину на стопку стерильной марли в стерилизованный металлический лоток под капотом дыма. Вымойте каждый хорошо три раза с 200 микролитров свежего Ac среды на колодец. После последней стирки инкубировать со-культуры с 20 микролитров свежей среды дополняется амикацин на колодец, чтобы устранить все оставшиеся внеклеточные микобактерии в течение двух часов.
Затем три моет в свежем Ac среды, как только что продемонстрировали. Затем добавьте 200 микролитров среды, дополненных свежим амикацином к каждой хорошо, а затем добавление в пять раз 10 до семи тепловых инактивированных бактерий Escherichia coli. После 48 часов, лизировать клетки с 10 микролитров 10% додекилового сульфата натрия на колодец, в течение 30 минут при 32 градусах по Цельсию, и распространение пяти микролитров лизата на пластинах Columbia Agar, содержащих 5%овец крови.
Далее разбавляют лизаты, добавляя по 25 микролитров стерильной воды на каждую каплю. Когда все лисаты были побелены, запечатать пластины с пластиковой парафиновой пленкой, и инкубировать культур в течение трех-четырех дней при 37 градусов по Цельсию. Когда колонии появляются на пластинах, сфотографировать культуры и определить мутантов, нарушенных для внутриклеточного роста отложений с наименьшим количеством бактериальных колоний.
Для внутриклеточной экстракции РНК микобактерий сначала вырастите M.abscessus в среде 7H9, дополненной глицеролом и глюкозой, до средней экспоненциальной фазы в 50 миллилитровых трубках при 120 об/мин. В конце культуры, мыть бактерии два раза с 10 миллилитров буфера Ac на стирку, и измерить O.D.600 для оценки концентрации бактерий. Далее добавьте 8,5 раза 10 к восьми микобактериям в 8,5 раза 10 до шести амеб в 10 миллилитров свежей ac среды в течение одного часа инкубации при 30 градусах по Цельсию и 80 об/мин.
В конце инкубации, собирает клетки центрифугации, и мыть гранулы три раза в 10 миллилитров свежего буфера Ac на стирку в тех же условиях центрифуги. Затем повторно приостановить клетки в 10 миллилитров свежего буфера Ac дополняется амикацин для устранения любых внеклеточных бактерий, и инкубировать клетки в течение четырех часов при 30 градусов по Цельсию и 80 об /мин, а затем два моет в свежем буфере Ac. После последней стирки, повторно приостановить инфицированных амеб в четырех миллилитров холодного раствора три, дополненный 280 микролитров бета меркаптоэтанола нарушить амебы на льду в течение 10 минут.
В конце инкубации центрифуга клетки лисируют гранулы выпущенных внутриклеточных бактерий, и повторно приостановить бактериальные гранулы в один миллилитр холодного раствора три. Важно удалить все супернатанты, чтобы избежать загрязнения амебой РНК или протеаз, которые могли бы сделать образцы. Урожай высвобождаемых бактерий со второй центрифугации, и повторно приостановить гранулы в один миллилитр буфера извлечения.
Затем инкубировать в течение 24 часов при отрицательном 80 градусов по Цельсию. Передача микобактериального раствора в две миллилитровые винтовые трубки, содержащие зирконий бусы до 500 микролитров градации знак, и хранить трубки в течение еще 24 часов при отрицательном 80 градусов по Цельсию для облегчения активации РНК син и растворения клеток. В день анализа оттаивать образцы на льду, и подлизать клетки с двумя раундами гомогенизации при 6000 об/мин в течение 25 секунд, а затем один раунд гомогенизации при 6000 об/мин в течение 20 секунд.
В период между каждым раундом гомогенизации, охладить образцы на льду в течение одной минуты, чтобы избежать деградации РНК. После третьего раунда гомогенизации, охладить образцы на льду в течение 20 минут, и добавить 200 микролитров хлороформа разбавленного изоамилового спирта в каждой трубке. Вихрь в течение одной минуты, затем центрифуга образцов, и добавить 0,8 миллилитров холодного изопропанола в aqueous фазы в течение двух-трех часов инкубации при отрицательном 20 градусов по Цельсию.
В конце инкубации, центрифуга образцов снова, и мыть гранулы в 500 микролитров холодного 70% этанола без смешивания. Затем немедленно удалить этанол центрифугации. Аспирировать супернатант для сушки гранул в центробежной концентратор, и повторно приостановить гранулы в 100 микролитров ДНК / РНК-свободной воды.
Mycobacterial MRNA экстракции, как попродемонстрировано, позволяет оценки индуцированных и репрессированных семей генов путем группировки генов в соответствии с их ролью в реагировании на окружающую среду ограничен в его источник питательных веществ и минералов, или гипоксической или кислой среде. В устойчивости к окислительного и нитросативного стресса, или в выражении факторов вирулентности в ответ на амебу окружающей среды. При попытке этих процедур, важно помнить, чтобы выполнить культуру и РНК изоляции контролируемых и инфицированных образцов в то же время, чтобы избежать побочных эффектов.
Следуя этой процедуре, другие методы, такие как двойное секвенирование РНК, могут быть заранее сформированы, чтобы ответить на дополнительные вопросы о взаимодействии патогенов-хозяина. После его развития, этот метод проложил путь для исследователей в области микробиологии к микобактерии вирулентности в модели хозяина амебы. Не забывайте, что работа с амебами может быть чрезвычайно опасной, так как амебы могут превратиться в кисты, если вы не будете следовать шагам, описанным в процедуре.
