Эта работа получила поддержку исследований студенчества Норвич по парк (JR), Совместный инжиниринг и физических наук исследовательский совет/биотехнологий и финансируемых СИББН Совета исследований биологических наук научно-исследовательский центр синтетической биологии OpenPlant Грант (BB / L014130/1) (M.J.S., А.О.); Джон Иннес Центр обмена знаниями и коммерциализации Грант (BB/KEC1740/1) (B.B.); и СИББН Институт стратегической программы грантов «Молекулы от природы» (BB/P012523/1) и Фонда Джона Innes (даф). Мы хотели бы поблагодарить Джордж Lomonossoff для предоставления векторов pEAQ и Эндрю Дэвис для фотографии.

<ol>
	<li>Thimmappa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triterpene+biosynthesis+in+plants.">Triterpene biosynthesis in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 65, 225-257 (2014).</li><li>Seki, H., Tamura, K., Muranaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P450s+and+UGTs:+Key+players+in+the+structural+diversity+of+triterpenoid+saponins.">P450s and UGTs: Key players in the structural diversity of triterpenoid saponins.</a> Plant Cell Physiology. 56 (8), 1463-1471 (2015).</li><li>Roy, A., Saraf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limonoids:+overview+of+significant+bioactive+triterpenes+distributed+in+plants+kingdom.">Limonoids: overview of significant bioactive triterpenes distributed in plants kingdom.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 29 (2), 191-201 (2006).</li><li>Kamble, S. M., Goyal, S. N., Patil, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+pentacyclic+triterpenoids+as+adjuvants+in+cancer+chemotherapy:+a+review.">Multifunctional pentacyclic triterpenoids as adjuvants in cancer chemotherapy: a review.</a> RSC Advances. 4 (63), 33370-33382 (2014).</li><li>Liby, K. T., Sporn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+oleanane+triterpenoids:+multifunctional+drugs+with+a+broad+range+of+applications+for+prevention+and+treatment+of+chronic+disease.">Synthetic oleanane triterpenoids: multifunctional drugs with a broad range of applications for prevention and treatment of chronic disease.</a> Pharmacological Reviews. 64 (4), 972-1003 (2012).</li><li>Yadav, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+inflammatory+pathways+by+triterpenoids+for+prevention+and+treatment+of+cancer.">Targeting inflammatory pathways by triterpenoids for prevention and treatment of cancer.</a> Toxins. 2 (10), 2428-2466 (2010).</li><li>Christensen, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ginsenosides+chemistry,+biosynthesis,+analysis,+and+potential+health+effects.">Ginsenosides chemistry, biosynthesis, analysis, and potential health effects.</a> Advances in Food and Nutrition Research. 55, 1-99 (2009).</li><li>Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+synthetic+biology+platform+for+rapid+access+to+gram-scale+quantities+of+novel+drug-like+molecules.">A translational synthetic biology platform for rapid access to gram-scale quantities of novel drug-like molecules.</a> Metabolic Engineering. 42, 185-193 (2017).</li><li>Andersen-Ranberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+landscape+of+diterpene+structural+diversity+through+stereochemically+controlled+combinatorial+biosynthesis.">Expanding the landscape of diterpene structural diversity through stereochemically controlled combinatorial biosynthesis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 55 (6), 2142-2146 (2016).</li><li>Peyret, H., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pEAQ+vector+series:+the+easy+and+quick+way+to+produce+recombinant+proteins+in+plants.">The pEAQ vector series: the easy and quick way to produce recombinant proteins in plants.</a> Plant Molecular Biology. 83, 51-58 (2013).</li><li>Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pEAQ:+versatile+expression+vectors+for+easy+and+quick+transient+expression+of+heterologous+proteins+in+plants.">pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants.</a> Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).</li><li>Sainsbury, F., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+high-level+and+rapid+transient+protein+production+in+plants+without+the+use+of+viral+replication.">Extremely high-level and rapid transient protein production in plants without the use of viral replication.</a> Plant Physiology. 148 (3), 1212-1218 (2008).</li><li>Voinnet, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+transient+expression+system+in+plants+based+on+suppression+of+gene+silencing+by+the+p19+protein+of+tomato+bushy+stunt+virus.">An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus.</a> The Plant Journal. 33 (5), 949-956 (2003).</li><li>Holtz, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commercial-scale+biotherapeutics+manufacturing+facility+for+plant-made+pharmaceuticals.">Commercial-scale biotherapeutics manufacturing facility for plant-made pharmaceuticals.</a> Plant Biotechnology Journal. 13 (8), 1180-1190 (2015).</li><li>Bucar, F., Wubea, A., Schmidb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+product+isolation+-+how+to+get+from+biological+material+to+pure+compounds.">Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds.</a> Natural Product Reports. 30, 525-545 (2003).</li><li>Kaufmann, B., Christen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+extraction+techniques+for+natural+products:+microwave-assisted+extraction+and+pressurised+solvent+extraction.">Recent extraction techniques for natural products: microwave-assisted extraction and pressurised solvent extraction.</a> Phytochemical Analysis. 13 (2), 105-113 (2002).</li><li>Larsen, E., Christensen, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+saponification+method+for+the+quantitative+determination+of+carotenoids+in+green+vegetables.">Simple saponification method for the quantitative determination of carotenoids in green vegetables.</a> Journal of Archaeological and Food Chemistry. 53 (17), 6598-6602 (2005).</li><li>Sainsbury, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+virus-derived+system+to+manipulate+plant+natural+product+biosynthetic+pathways.">Using a virus-derived system to manipulate plant natural product biosynthetic pathways.</a> Methods Enzymology. , 185-202 (2012).</li><li>Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Cloning+using+in+vitro+site-specific+recombination.">DNA Cloning using in vitro site-specific recombination.</a> Genome Research. 10, 1788-1795 (2000).</li><li>Ting, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNARE-RNAi+results+in+higher+terpene+emission+from+ectopically+expressed+caryophyllene+synthase+in+Nicotiana+benthamiana.">SNARE-RNAi results in higher terpene emission from ectopically expressed caryophyllene synthase in Nicotiana benthamiana.</a> Molecular Plant. 8, 454-466 (2015).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+production+of+artemisininin+in+Nicotiana+benthamiana+is+boosted+by+a+specific+lipid+transfer+protein+from+A.+annua.">Transient production of artemisininin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua.</a> Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).</li><li>Nielsen, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redirecting+photosynthetic+reducing+power+toward+bioactive+natural+product+synthesis.">Redirecting photosynthetic reducing power toward bioactive natural product synthesis.</a> ACS Synthetic Biology. 2, 308-315 (2013).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoterpene+biosynthesis+potential+of+plant+subcellular+compartments.">Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments.</a> New Phytologist. 209, 679-690 (2016).</li><li>Ferrero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+morphogenesis+of+the+endoplasmic+reticulum+driven+by+the+membrane+domain+of+3-hydroxy-3-methylglutaryl+Coenzyme+A+reductase+in+plant+cells.">Proliferation and morphogenesis of the endoplasmic reticulum driven by the membrane domain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A reductase in plant cells.</a> Plant Physiology. 168, 899-914 (2015).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Высок через положило инфильтрации вакуум позволяет этот протокол к регулярно использоваться в нашей Лаборатории препаративные производства тритерпеновых соединений, представляющих интерес для различных приложений, вниз по течению. Аппарат вакуумной инфильтрации, описанный здесь легко повторить. Вакуумный резервуар является целесообразным, чтобы уменьшить время, необходимое для тянуть необходимые вакуум, однако это можно просто перепрофилировать неизмененных вакуумной печи как проникновение камеры. Защита вакуумный насос через Добавление подходящих конденсатора теоретически разумное, но в нашей лаборатории мы нашли это ненужным.
Проникновения покрытия нарушается, если листья не являются полностью погружен в инфильтрации подвеска. Эта проблема сводится к минимуму, обеспечивая уровень подвески достигает верхней поверхности держателя растений, и что владелец завода плотное прилегание бане инфильтрата. Из рисунка 2 Обратите внимание, что верхней поверхности держателя завод утоплена в ванну инфильтрации в месте. Это достигается путем панелей по краям среднего держателя, которые формируют опорную точку с верхней части в бане инфильтрата. Проникновение подвеска потребует периодические дополнения для поддержания уровня подвески. Это лучше всего достигается добавлением избыток инфильтрации подвеска для предотвращения постепенного сокращения ОД600 в течение большого загрузочных инфильтрации. Однако в наших руках, замещение воды не кажется иметь заметное влияние на ожидаемые урожаи в препаративных масштабе, хотя это не было quantitively расследование. Как многие растения может быть проникли из одной партии инфильтрации подвеска по-прежнему является открытым вопросом. Мы регулярно проникают между 100 и 200 растений с одной партии инфильтрации подвеска. Кроме того это нормально для некоторых почвы выщелачиваться в подвеска инфильтрации в течение процесса инфильтрации. Это не было установлено, что заметно влияет на эффективность проникновения.
Во время уборки урожая это желательно (но не критично) урожай только листья, которые были проникли (некоторые листья будут выросли после проникновения). Селективный сбор предотвращает разрежения с непродуктивными ткани, которая бы в противном случае повысить соотношение эндогенного примесей относительно комплекса интереса. Это имеет номинального влияние на легкость очистки ниже по течению и увеличивает масштаб этих процессов. При использовании tHMGR для увеличения поставок прекурсоров, разработать на период после проникновения роста часто наблюдается necrosed фенотип. Это нормально и фактически СПИД селективного сбора урожая и ниже по течению процесса сушки. Сушеные листья порошка обычно может храниться в загерметизированном контейнере в прохладном, сухом, темном месте, но в идеале в эксикатор под вакуумом. Это зависит от стабильности состава заинтересованных. Если решили хранить в морозильной камере-80 ° C следует соблюдать осторожность. Убедитесь, что сушеные листья находятся в водонепроницаемый контейнер и на удалении от хранения, разрешить этот контейнер, чтобы нагреть до комнатной температуры до открытия. Невыполнение этого требования приведет к антистатического листьев, препятствуя вниз поток обработки.
Послеуборочных шаги в этом протоколе предоставляются для иллюстративных целей, и для оказания помощи опыт тех исследователей, которые могут иметь ограниченный практический химии. Они могут заменить многие другие методы извлечения/очистки натуральный продукт. Как указано во введении PSE имеет много преимуществ, однако капитальных затрат на коммерчески доступных PSE аппарата может быть непомерно высока, и не важно. Основные ионообменные смолы лечения является очень удобный метод для замены традиционных омыления следуют жидкость/жидкость секционирование. Однако это не подходит для продуктов, содержащих карбоновые кислоты группы или функциональных групп, которые бы гидролизуется в основных условиях, например эфиры. Ожидается, что эти продукты будут храниться на основных ионообменных смол. Однако есть потенциал, чтобы использовать это для записи и выпуска процедуры (не документированы). Там, где традиционные омыления целесообразно, основных ионообменных смол лечения служит удобной альтернативой. Было установлено, что метод хроматографии, описанный в шаге 9, быть обобщению для соединений, описанных в рисунке 3. Однако соединений повышенной полярности может потребовать продолжительного периода элюции 100% этиловый ацетат. Со ссылкой на шаг 9.2 ниже по течению тонкой очистки полностью комплекса конкретных и также зависит от масштаба. Неоднократные раунды меньшего масштаба флэш-хроматографии с оптимизированной градиенты, обычно достаточно для достижения чистоты подходит для ЯМР анализ. В более крупных масштабах кристаллизация часто является удобной альтернативой. В сложных случаях в зависимости от желаемого количества изолированных соединения могут быть использованы препаративные или полу препаративные высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Примеры процессов течению очистки для ряда представительных соединений можно найти в другом месте8.
Текущий протокол, как здесь представлены, обычно используется в нашей лаборатории и доказала свою полезность. Однако есть еще значительные возможности для дальнейшей оптимизации выражение платформы. Работа продолжается в нашей лаборатории расследовать как дальнейшие пути инженерных и дифференциальный контроль над уровнях выражения протеина может улучшить тритерпеновых производства далее, при посреднической токсичности для клеток хозяина. Существует также вероятность расследовать манипуляции внутриклеточных транспортных систем20,21и направление ферментов для различных клеточных отсеков22,23, пути, которые могли бы улучшить эффективность окисления нескольких событий. Можно также изучить потенциальные выгоды для изменения базовой морфологии основных органеллы. К примеру гиперэкспрессия мембраны домена Arabidopsis thaliana HMGR наблюдается побудить гипертрофия эндоплазматического ретикулума растений24; Основные сайта для CYP450 деятельности. Этот протокол идеально подходит для производства миллиграмм на грамм шкала количества тритерпеновых продуктов и может применяться в условиях исследований для доступа соединений ниже по течению исследования (например, систематическое изучение структура активность отношения и предварительные расследования для фармакокинетические и фармакодинамические свойства соединения свинца клинический интерес). Однако платформа линейно и надежно масштабируемой, просто увеличив количество растений используется и практичности переходных выражения через agroinfiltration была продемонстрирована в промышленных масштабах для производства фармацевтических протеинов 14, таким образом существует потенциал для этой платформы, чтобы быть продлен для коммерческого производства тритерпенов высокой стоимости. Кроме того, это также возможно представить производства стабильных трансформантов носить окончательный желание градиентный биосинтетических путь, позволяющий массового культивирования и продолжающееся «выращивание» трансгенных N. benthamiana штаммы производство различных соединений коммерческой ценности.

<table><tbody><tr><td>GC-MS instrument</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler suitable for performing PCR reactions</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Gel electrophoresis apparatus</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 100 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L, 10 &amp;micro;L, and 2 &amp;micro;L )</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/&gt; 15000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/&gt; 4000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/&gt; 4000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Standing incubator</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge bottles (1 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum infiltration apparatus</td><td>bespoke</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>9 x 9 cm plant pots</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Freeze drying apparatus (=/&gt; 8 litre condenser capacity)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument)</td><td>Buchi</td><td>SpeedExtractor E-914</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator apparatus</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Spatulas (assorted sizes)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Analytical balance (5 figures)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Balance (2 figures)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>A -80 freezer</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument</td><td>Biotage</td><td>ISO-1EW</td><td></td></tr><tr><td>Safety glasses</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Lab coat</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Consumables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette tips (Sizes : 1000 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 100 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L, 10 &amp;micro;L, and 2 &amp;micro;L )</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Transfer pipettes (size 2 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (Size: 100 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage&amp;reg; SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges</td><td>Biotage</td><td>FSK0-1107-0100</td><td></td></tr><tr><td>HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Disposable purple nitrile gloves</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Top filter for E-914, cellulose</td><td>Buchi</td><td>51249</td><td></td></tr><tr><td>Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber</td><td>Buchi</td><td>11055932</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quartz sand, 0.3 - 0.9 mm</td><td>Buchi</td><td>37689</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545 (diatomaceous earth)</td><td>Simga-Alrich</td><td>22140-1KG-F</td><td></td></tr><tr><td>Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm)</td><td>Merck</td><td>1.09385.5000</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Simga-Alrich</td><td>208337-100G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Simga-Alrich</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo;5&amp;rsquo;-dimethoxy-4&amp;rsquo;-acetophenone (acetosyringone)</td><td>Simga-Alrich</td><td>D134406-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60836</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Gibco</td><td>11815-032</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Simga-Alrich</td><td>S6501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>MP biomedicals</td><td>190057</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE gel</td><td>Melford</td><td>MB1203</td><td></td></tr><tr><td>LB broth Millar</td><td>Simga-Alrich</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Simga-Alrich</td><td>A5306-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Alrich</td><td>M2773-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Alrich</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ambersep&amp;reg;&amp;nbsp;900 hydroxide (basic ion exchange resin)</td><td>Sigma-Alrich</td><td>06476-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Fisher</td><td>H/0406/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher</td><td>E/0900/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Fisher</td><td>D/1852/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>M/4056/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Sigma-Alrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>20821-330</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q water</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F1 Compost</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F2 Compost</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit).</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha Competent E. coli</td><td>Supplier New England Biolabs Ltd</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>pEAQ-HT-DEST1 vector</td><td>Lomonossoff laboratory John Innes Center</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pDONR207</td><td>Thermo-Fisher</td><td>pDONR207</td><td></td></tr><tr><td>A. tumefaciens LBA4404</td><td>Thermo-Fisher</td><td>18313015</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M7822</td><td></td></tr><tr><td>PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE</td><td>New England Biolabs Ltd</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP SET 100mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>RNEASY PLANT MINI KIT</td><td>Qiagen Ltd</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNASE-FREE DNASE</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Fisher</td><td>10308632</td><td></td></tr><tr><td>Trytone</td><td>Sigma-Alrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana seeds</td><td>any reputable supplier</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

transient expression in nicotiana benthamiana leaves for triterpene production at a preparative scale

Тритерпенов являются одним из крупнейших и наиболее структурно различных семей натуральных растений. Многие производные тритерпеновых было показано, обладают лечебных соответствующей биологической активности. Однако до настоящего времени этот потенциал не переведены на множество тритерпеновых производных препаратов в клинике. Это возможно (по крайней мере частично) является следствием ограниченного практического синтетических доступ к этому классу соединения, проблема, которая может задушить исследованию отношений структура активность и развитие привести кандидатов от традиционных лекарственных рабочие процессы химии. Несмотря на огромное разнообразие, тритерпенов все производные от одного линейного прекурсор, 2,3-oxidosqualene. Переходных гетерологичных выражение биосинтетических ферментов в н. benthamiana может отвлечь эндогенных запасов 2,3-oxidosqualene на производство новой продукции тритерпеновых высокой стоимости, которые естественно не производятся этот узел. Агро инфильтрации является эффективным и простым средством достижения переходных выражение в н. benthamiana. Этот процесс включает инфильтрации растений листья с подвеской Agrobacterium tumefaciens перевозящих construct(s) выражение интереса. Совместное проникновение дополнительных A. tumefaciens штамма, перевозящих что выражение конструкции кодировку фермент, который повышает поставок прекурсоров значительно увеличивает урожайность. После в течение пяти дней можно собирают и обрабатываются для извлечения и изолировать результирующий тритерпеновых товар(ов) проникли листовой материал. Это процесс, который масштабируется линейно и надежно, просто увеличив количество растений, используемых в эксперименте. Здесь будет описано протокол для быстрой подготовке масштабного производства тритерпенов, используя этот завод-платформе. Протокол использует аппарат легко воспроизводимые инфильтрации вакуум, который позволяет одновременное проникновение до четырех растений, позволяя загрузочных проникновение сотни растений в течение короткого времени.

Типичный изолированных урожайность зависят от комбинации фермента/фермента под расследование, химическая стабильность целевого соединения и как сложный процесс очищения был. Мы уже ранее сообщали отдельные выходы β-очень производные от наших экспериментов комбинаторные биосинтез, начиная от 0,12 до 3,87 мг на грамм сухой порошок листьев н. benthamiana . Эти соединения широко колебались на уровне окисления и включены неестественные сочетания ферментов (рис. 3)8. Этот протокол используется обычно в нашей лаборатории производить десятки или сотни миллиграммов очищенного продукта для структурных характеристик ЯМР спектроскопии и ниже по течению функциональных анализов. Мы также продемонстрировали препаративные полезности этой платформы, производя 0.8 g тритерпеновых эшафот β-очень на чистоту более чем 98%. Этот эксперимент используется 459 растений и представляет собой изолированное урожайность 3,3 мг на грамм сухого N. benthamiana лист порошок8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig1.jpg"> Рисунок 1: схема резюме. Схематическое изображение процесса использования переходных выражение биосинтетических ферментов в н. benthamiana лист отвлечь эндогенных запасов 2,3-oxidosqualene к препаративные производства новых продуктов высокой стоимости тритерпеновых. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig2.jpg"> Рисунок 2: вакуумные лазутчик строительство и процесс.) Заказ завод одно крыло держатель отсоединена. b) Bespoke завод держатель крыльев. c) инверсии и погружения растений. d) вставки инфильтрации ванны. Ванна e) инфильтрации в место в зале инфильтрации. f) полная вакуума лазутчик: (1) вакуумный насос (2) подключение вакуумного насоса в вакуумной водохранилище (3) вакуумный резервуар изоляции клапан (4) связь между вакуумный резервуар и инфильтрации камеры (5) манометр (6) воздуха впускного клапана (7) Камеры (8) инфильтрации вакуум водохранилище. g) представитель листья из одного растения, проникли с конструкцией выражение для зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) после пяти дней после проникновения роста. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig3.jpg"> Рисунок 3: ранее сообщал представитель результаты для подготовительного производства β-очень производных, используя этот протокол8. Эта таблица упорядочивается по изолированным урожайности. Условно столбцы форматируются с указанием относительного значения цвета. Красный = высокий, зеленый = низкий (хотя промежуточные желтый). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale at JoVE.com

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Переходных выражение в Nicotiana Benthamiana листья для производства тритерпеновых препаративные масштаба

Переходных гетерологичных выражение биосинтетических ферментов в Nicotiana benthamiana листья могут отвлечь эндогенных запасов 2,3-oxidosqualene на производство новой продукции тритерпеновых высокой стоимости. Здесь будет описано подробный протокол для быстрого (5 дней) подготовке масштабного производства тритерпенов и аналогов, используя этот мощный завод-платформе.

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

transient-expression-nicotiana-benthamiana-leaves-for-triterpene

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

17.2K Views.  John Innes Centre. Переходных гетерологичных выражение биосинтетических ферментов в Nicotiana benthamiana листья могут отвлечь эндогенных запасов 2,3-oxidosqualene на производство новой продукции тритерпеновых высокой стоимости. Здесь будет описано подробный протокол для быстрого (5 дне...

Video: Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Переходные экспрессии генов в табак с помощью Gibson Ассамблею и генной пушки

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Environment

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture organisms, such as hyphae-building fungi and anaerobic bacteria, has hastened the use of recombinant technologies in this field. Plant expression methods are a desirable system for large-scale production of enzymes and other industrially useful proteins. Herein, methods for the transient expression of a fungal endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A, in Nicotiana tabacum are demonstrated. Successful protein expression is shown, monitored by fluorescence using an mCherry-enzyme fusion protein. Additionally, a set of basic tests are used to examine the activity of transiently expressed T. reesei Cel5A, including SDS-PAGE, Western blotting, zymography, as well as&#160;fluorescence and dye-based substrate degradation assays. The system described here can be used to produce an active cellulase in a short time period, so as to assess the potential for further production in plants through constitutive or inducible expression systems.

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Tobacco plants were used to produce a fungal cellulase, TrCel5A, via a transient expression system. The expression could be monitored using a fluorescent fusion protein, and the protein activity was characterized post-expression.

Экспрессия рекомбинантных Целлюлаза Cel5A от<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; В растениях табака

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug used to treat depression and anxiety by binding to the serotonin transporter with high-affinity, blocking serotonin reuptake. Here we report an efficient procedure and a set of tools to stabilize, express, purify, and crystallize serotonin transporter-antibody complexes bound to S-citalopram and other antidepressants. Mutations which stabilize the serotonin transporter were identified using an S-citalopram binding assay. Serotonin transporter expressed in baculovirus-transduced HEK293S GnTI- cells, was reconstituted into proteoliposomes and used to raise high-affinity antibodies. We have developed a strategy to discover antibodies that are useful for structural studies. A straightforward approach for the expression of antibody fragments in Sf9 cells has also been established. Transporter-antibody complexes purified using this procedure are well-behaved and readily crystallize, producing complexes with S-citalopram that diffract X-rays to 3-4 &#197; resolution. The strategies developed here can be utilized to determine the structure of other challenging membrane proteins.

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

This manuscript describes how to screen for thermostabilizing mutations, purify the human serotonin transporter, generate high affinity antibodies, and crystallize the serotonin transporter-antibody complex bound to the antidepressant drug S-citalopram. This protocol can be adapted to the study of other challenging membrane transporters, receptors, and channels.

Термостабилизации, Expression, очистки и кристаллизации Серотонин Transporter человека Обязанный<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

Настраиваемый подход к ферментативным производством и очистке терепенидов натуральных продуктов

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Эффективное Агроинфильтрация растений для высокого уровня переходных Экспрессия рекомбинантных белков

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Biology

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

Оптимизация и использование<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Опосредованного переходных Белок Производство в<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

Сравнительный анализ рекомбинантного белка слова в разных биофабрик: бактерии, клетках насекомых и растительных систем

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Assay Imaging Люцифераза дополнения в листьях Nicotiana benthamiana временно определения динамики взаимодействия протеин протеина

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing need in developing efficient methods for recombinant antibody production. As of 2019, there were more than 70 FDA-approved monoclonal antibodies, and there is exponential growth potential. Despite their promise, limiting factors for widespread use are manufacturing costs and complexity. Potentially, plants offer low-cost, safe, and easily scalable protein manufacturing&#160;strategies. Plants like Nicotiana benthamiana not only can correctly fold and assemble complex mammalian proteins but also can add critical post-translational modifications similar to those offered by mammalian cell cultures. In this work, by using native GFP and an acid-stable variant of green fluorescent protein (GFP) fused to human monoclonal antibodies, we were able to visualize the entire transient antibody expression and purification process from N. benthamiana plants. Depending on the experiment&#39;s purpose, native GFP fusion can ensure easier visualization during the expression phase in the plants, while acid-stable GFP fusion allows for visualization during downstream processing. This scalable and straightforward procedure can be performed by a single researcher to produce milligram quantities of highly pure antibody or antibody fusion proteins in a matter of days using only a few small plants. Such a technique can be extended to the visualization of any type of antibody purification process and potentially many other proteins, both in plant and other expression systems. Moreover, these techniques can benefit virtual instructions and be executed in a teaching laboratory by undergraduate students possessing minimal prior experience with molecular biology techniques, providing a foundation for project-based exploration with real-world applications.

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

We describe here a simple method for expression, extraction, and purification of recombinant human IgG fused to GFP in Nicotiana benthamiana. This protocol can be extended to purification and visualization of numerous proteins that utilize column chromatography. Moreover, the protocol is adaptable to the in-person and virtual college teaching laboratory, providing project-based exploration.

Производство белков IgG Fusion, постоянно выраженных в Никотиана бентамиана

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Эффективное извлечение и очистка GFP-His из листьев N. benthamiana

Apoplast-Extraction Based Method to Improve the Purity of Plant Produced Recombinant Protein

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from plants is one of the most critical steps in the production process. Typically, proteins were purified from total soluble proteins (TSP), and the presence of miscellaneous intracellular proteins and cytochromes poses challenges for subsequent protein purification steps. Moreover, most therapeutic proteins like antigens and antibodies are secreted to obtain proper glycosylation, and the presence of incompletely modified proteins leads to inconsistent antigen or antibody structures. This work introduces a more effective method to obtain highly purified recombinant proteins from the plant apoplastic space. The recombinant Green fluorescent protein (GFP) is engineered to be secreted into the apoplast of Nicotiana benthamiana and is then extracted using an infiltration-centrifugation method. The GFP-His from the extracted apoplast is then purified by nickel affinity chromatography. In contrast to the traditional methods from TSP, purification from the apoplast produces highly purified recombinant proteins. This represents an important technological improvement for plant production systems.

В центре внимания автора: Оптимизация экстракции белка апопластов для эффективного восстановления рекомбинантных белков из растительных клеток

The purification of recombinant proteins from plant systems is usually challenged by plant proteins. This work provides a method to effectively extract and purify a secreted recombinant protein from the apoplast of Nicotiana benthamiana.

Метод экстракции апопластов для повышения чистоты рекомбинантного белка растительного происхождения  

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from ...

Переходных выражение в Nicotiana Benthamiana листья для производства тритерпеновых препаративные масштаба

Резюме

Смотреть дополнительные видео

PLAYLIST