Наша методика позволяет точное изображение легких накопленных иммунных клеток человека в воспалительных условиях in vivo обеспечивая захватывающее понимание процесса самонаведения Т-клеток легких. Этот протокол поддерживает трансляционные исследования самонаведения Т-клеток легких и тем самым может помочь в выявлении новых целей для оптимизированной терапии воспалительных или аллергических легочных заболеваний. В частности, способность учитывать влияние специфических заболеваний иммунных клеток, организации легочной ткани и воспалительной среды на самонаводяние Т-клеток легких делает этот метод весьма выгодным.
В целом, наша методика имеет большое значение для иммунологических исследований в области хронических воспалительных заболеваний легких, которые часто обусловлены подавляющим накоплением тканей активированных иммунных клеток. После подтверждения отсутствия ответа на щепотку ноша в по крайней мере 16-граммовый, шестинедельный, анестезированной C57 черный 6J мыши, использовать микропайп медленно доставить 10 микролитров свежеприготовленного раствора папаина в одну ноздрю мыши один раз в день в течение трех дней подряд. На следующий день после последней администрации папаина, слой 10 миллилитров Ficoll среды под человеческой периферической крови от здорового добровольца предварительно разбавленных на один-два соотношения в PBS для разделения градиента плотности центрифугации.
Перенесите периферические моноядерные кровяные клетки или межфазный слой PBMC в новую 50-миллилитровую трубку и соберите клетки путем центрифугации. Далее, выполнить магнитную изоляцию микропиба CD4 положительные клетки в соответствии с протоколом производителя. Повторное приостановление бисера изолированных CD4 положительных Т-клеток до одного раза десять седьмой Т-клеток, по крайней мере 500 микролитров концентрации PBS.
Этикетка клеток с соответствующим красным светом возбудимого красителя пролиферации клеток в течение 10 минут при 37 градусах по Цельсию. В конце инкубации, арест маркировки реакции с пятью томами RPMI среднего дополнены 10%FBS в течение пяти минут на льду, а затем три моет в среде. Для принятия передачи человека CD4 положительные Т-клетки в папаин-открытых мышей-реципиентов, повторно приостановить флуоресцентно помечены Т-клеток в один раз от 10 до седьмой клетки на миллилитр концентрации в PBS и загрузить 100 микролитров клеток в один миллилитров шприц оснащен 30-го калибра иглы на животное получателя, а затем ввести весь объем клеток из одного шприца в хвостовой вены папаин-обработанных животных поддержания иглы кончик в вену для дополнительного через пять секунд после доставки ячейки, чтобы предотвратить разряда подвески ячейки.
Через три часа после передачи приемной клетки проткните правый желудочек каждой усыпляемой мыши канюлей 21-го калибра, подключенной к катетеру, и сделайте разрез в левом желудочковом отверстии. Медленно пронизыть легкое с 20 миллилитров ледяной PBS дополнены пять миллимолейных EDTA следуют два миллилитров ледяной 4%paraformaldehyde. Когда все фиксатор был промыт через ткань, удалить слюнные железы и сократить стернальной гиоидной мышцы, чтобы типсы, чтобы быть скользнул под трахеей подвергать ткани airtube.
Выполните первоначальный прокол открытой трахеи с 30-го калибра иглы перед заменой иглы с тупым 30-калибровочный катетер, чтобы предотвратить дальнейшее повреждение ткани. Используйте держатель иглы, чтобы запечатать соединение между вставленным катетером и трахеей, и тщательно заполнить дыхательные пути примерно 37 градусов по Цельсию 0,75%agarose до полного раскрытия легких. Плотное соединение между катетером и трахеей имеет решающее значение для расширения легких до его физиологических размеров и поддержания архитектуры тканей для визуализации.
Когда агароза полностью затвердеет, удалите катетер и тщательно перенесите легкое в затемненную, двухми миллилитровую трубку, наполненную 4%paraformaldehdye. Далее, обезвоживать ткани с последовательными инкубации этанола под непрерывным вращением на 31 вращения в минуту и четыре градуса по Цельсию, как указано в течение четырех часов на инкубацию. После полного обезвоживания, передать образец в этиловый циннамат для ночной инкубации при комнатной температуре, пока ткань не появится полупрозрачной.
Для свето-листовой флуоресцентной микроскопии используйте небольшую каплю органического растворителя стабильного клея, чтобы приклеить легкое к владельцу образца микроскопа и установить легочную долей на держатель в вертикальном положении. Поместите держатель образца в камеру и выберите соответствующие лазеры для эксперимента в программном обеспечении прибора. Далее используйте ползунки под оптикой, чтобы установить ширину листа, что численная диафрагма, которые равномерно выявить весь орган или определенный раздел интереса.
Используйте ползунок, чтобы установить интенсивность лазера под контролем лазерной передачи для каждого выбранного лазера и нажмите Применить. Используйте расширенные настройки измерения для слияния левого и правого световых листов для создания однородно освещенного изображения. Определите стартовые и конечные позиции стека, которые будут измеряться в диапазоне сканирования, и установите размер шага до пяти микрометров, затем выберите автосейву для автоматического сохранения файлов и начните измерение для захвата изображений.
Когда все изображения были приобретены, активируйте кнопку Surpass в программном обеспечении для анализа 3D после визуализации и загрузите первое изображение из одного стека, чтобы инициировать открытие и автоматическую 3D-реконструкцию всех других изображений выбранного стека, а затем под корректировку дисплея, отрегулируйте интенсивность, черный уровень и контрастность для каждого канала. Для сравнения накопления человеческих клеток в легочной ткани в различных образцах, выберите Редактировать и урожай 3D для определения кубика легких с определенным объемом. Для количественной оценки помеченных ячеек в рамках определенного куба легких откройте Add New Spots в панели инструментов, нажмите кнопку Пропустить автоматическое творение, редактировать вручную, и выберите канал 640 нанометров.
Установите шкалу радиуса до 10,00 микрон, нажмите Выберите, и под редактировать, Shift нажмите левой кнопкой мыши, чтобы индивидуально пометить каждую флуоресцирование ячейки с точкой. Общее количество подсчитанных ячеек будет отображаться в статистике. Чтобы запечатлеть изображение, используйте инструмент моментального снимка и или используйте инструмент анимации для захвата видео.
Обогащение клеток на основе микробусов и последующая маркировка флуоресценции, как это обычно демонстрируется, приводят к положительной чистоте CD4 по крайней мере 95% и успешной маркировке этих клеток, определяемой цитометрией потока. Очистка тканей на основе этилового циннамата достигает высокого уровня прозрачности органов, что свидетельствует об успешном соответствии рефракционного индекса. Автофлуоресцентный сигнал легочной ткани предлагает полезный инструмент для изображения анатомические структуры легких с помощью светового листа микроскопии, которые могут отображаться в качестве проекции среднего интенсивности или в поверхностном режиме.
По сравнению с обычной микроскопией, световая микроскопия предлагает преимущество всей визуализации органов и последующей 3D-реконструкции, позволяющей идентифицировать и визуализировать пролиферацию красителя с маркировкой, переданных Т-клеток человека в контексте всего органа, кроме того, предпочтение переданных Т-клеток человека для селективного накопления в воспаленной легочной ткани папин-открытых животных также подтверждается тем фактом, что человеческие CD4 положительные Т-клетки не могут быть извлечены из кишечника. Для количественной оценки и сравнения легочного накопления человеческих CD4 положительных Т-клеток между различными условиями, помеченные клетки также могут быть подсчитаны в нескольких легких кубов определенного объема, как попродемонстрировано. Тщательная подготовка тканей, включая перфузию легких, инфляцию и очистку тканей, очень важна для оптимизированного поколения микроскопических изображений с высоким разрешением.
Для дальнейшего подтверждения успешного диапедеза переданных лимфоцитов человека, этот протокол может быть легко объединен с потоком цитометрической количественной оценки человеческих лимфоцитов в murine бронхоалвеолярной лаваж. Способность контролировать иммунные клетки, полученные от отдельных пациентов в условиях in vivo, поддерживает выявление функциональных изменений в иммунных клетках, отпечатанных конкретным заболеванием или терапией.
