Подготовка высококачественных масс-спектрометрических образцов для комплексного протеомного анализа глазных образцов имеет решающее значение для выяснения молекулярных механизмов и сигнальных путей, связанных со здоровьем и болезнями. Описанный рабочий поток представляет собой простой, но надежный подход к строгим шагам подготовки образцов, предназначенных специально для анализа массовых образцов, таких как глазные микро кровеносные сосуды. Хотя основная цель исследования заключается в создании совместимой с МС методологии для глазных кровеносных сосудов, описанный рабочий поток может быть широко применен к различным образцам на основе клеток и тканей.
Как правило, лица, новые для этого метода может бороться, потому что выявление и изоляция выбранной короткой задней цилиарной артерии, или SPCA филиалов, может быть сложной задачей. Свежие свиные глаза, вместе с зрительным нервом и экстраокулярными тканями, были получены из местной скотобойни сразу после смерти. Поместите глазной глобус в камеру вскрытия, содержащую ледяной буфер Кребс-Хенселейт.
Аккуратно отрежьте окружающие мышцы и ткани парой острых ножниц Майо. Сделайте разрез скальпелем и разрежьте земной шар вдоль экваториальной плоскости острыми ножницами майо до тех пор, пока глаз не будет разделен на переднюю и заднюю половинки. Удалите как можно больше стекловидного тела из задней половины глаза, используя пару стандартных хлипов шаблона.
После использования вскрытия булавки, чтобы тщательно приколоть заднюю половину глаза, аккуратно отрезать соединительной ткани, окружающие зрительный нерв, чтобы разоблачить основные ретробульбар сосуды с парой студентов Vannas весенние ножницы. Изолировать параоптической и дистальной короткой задней цилиарной артерии вместе с окружающими соединительной ткани с парой типа пять точность пинцета и Ваннас капсулотомии ножницы. Аккуратно удалить соединительные ткани из артериальных сегментов с помощью дополнительных тонкой наконечником пинцетом и ножницами, прежде чем полоскания изолированных артерий в ледяной PBS для удаления загрязняющих веществ и остатков крови.
Бассейн артерий от двух глаз, чтобы получить один биологический репликации, а затем взвесить образцы с помощью аналитического баланса. К каждой трубке добавьте смесь из 0,5 и одномиллиметровых бусинок оксида циркония, за которыми последует реагент извлечения белка тканей. Теперь загрузите пробные трубки в блендер гомогенизатора.
Установите таймер до двух минут, установите уровень скорости до шести и начните гомогенизацию. После запуска проверьте образцы на полную гомогенизацию и храните образцы на льду между каждым запуском. Повторите цикл до тех пор, пока образцы не будут полностью гомогенизированы.
Тщательно пипетка гомогената в свежие микроцентрифуг трубки. Центрифуга образцов в 10 000 раз G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия гранулировать нерастворимые белки. Тщательно пипетка супернатант, содержащий растворимые белки, не касаясь слоя гранул, и перейти в свежие микроцентрифуг трубки.
Добавьте 200 микролитров экстракции Buffer 2A и пять микролитров ингибитора протеазы в каждый образец гранул. Затем несколько раз приостанавливайте гранулы пипеткой. Используйте ультразвуковой гомогенизатор, чтобы полностью гомогенизировать гранулы.
Установите амплитуду до 60 и цикл к одному. Используйте зонд из титана, который подходит для гомогенизации образцов с небольшими объемами. Погрузите зонд в гранулы и экстракции буферной смеси на льду, и нажмите кнопку запуска.
Sonicate образца до гранулы сгустки полностью гомогенизированы, останавливаясь на несколько секунд между каждой sonication. Проверьте полную гомогенизацию визуально. Смешайте гомогенат несколько раз с пипеткой, чтобы убедиться, что нет сгустков.
Для этой процедуры используйте центробежные фильтровальные устройства с трехкилотонным вырезом. Вставьте трехкилотонный блок фильтра отсечения в трубку микроцентрифуга. Pipette 200 микролитров образца гомогената к одному фильтру устройства, и добавить 200 микролитров деионизированной воды в тот же фильтр.
После укупорки его надежно, поместите блок фильтра в центрифугу, и спина в течение 14000 раз G в течение 15 минут при четырех градусах по Цельсию. После центрифугации отделяйте блок фильтра, содержащий пробный концентрат, от микроцентрифугной трубки, содержащей фильтрат, отбрасывая фильтрат. Восстановить концентрат, добавив 400 микролитров деионизированной воды в блок фильтра.
После повторения фильтрации три раза, тщательно pipette очищенный образец концентрата в чистую микротрубку. Подготовьте образцы для одномерной электрофорез геля, перечисленных в текстовом протоколе, и хорошо перемешать с пипеткой. Нагрейте образцы при температуре 70 градусов по Цельсию в сухом нагревателе блока в течение 15 минут и охладите до комнатной температуры.
Тщательно загрузите 50 микрограммов образца на полосу с помощью пипетки, а также предварительно окрашенный стандарт белка в качестве молекулярного маркера массы. Запустите гели в течение примерно 60 минут при постоянном напряжении 175 вольт. В конце пробега осторожно снимите гель с кассетной пластины с помощью гелеобразного ножа и перенесите гель в гелевую коробку для окрашивания.
Выполните фиксацию и окрашивание геля, как описано в текстовом протоколе. Встряхните гели в окрашивание решение на ночь для лучших общих результатов. Тщательно decant окрашивания раствора и заменить 200 миллилитров деионизированной воды перед встряхивания гелей, по крайней мере семь-восемь часов в воде, чтобы очистить фон.
Акциз белковых полос из геля с чистыми новыми лезвиями микротомы. Нарежьте полосу на мелкие кусочки и аккуратно перенесите кусочки геля на 1,5-миллилитровые микроцентрифуги. Добавьте 500 микролитров раствора destaining, содержащего 100-миллимолярный бикарбонат аммония и ацетонитрил.
Инкубировать образцы при комнатной температуре в течение 30 минут, с редким встряхивания. Тщательно пипетки из destaining раствора. Проверьте визуально для любых труб с остаточным пятном, и повторить этот шаг, если гель штук по-прежнему окрашенных синий.
Добавьте около 400 микролитров свежеприготовленного раствора DTT и инкубировать при 56 градусах Цельсия в течение 30 минут. Отбросив уменьшающий раствор пипеткой, добавьте около 400 микролитров свежеприготовленного раствора IAA и инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут. Удалите алкилирование буфера с пипеткой и отбросьте.
Добавьте 500 микролитров аккуратного ацетонитрила при комнатной температуре в течение 10-15 минут, пока кусочки геля не сократятся и не станут непрозрачными. Pipette из ацетонитрила, и воздух-сухой гель штук в течение пяти до 10 минут под капотом. Затем пипетка 50 микролитров трипсина раствора в каждой трубке, чтобы полностью покрыть кусочки геля, и инкубировать трубки при четырех градусах по Цельсию.
Через 30 минут добавьте достаточный объем буфера трипсина, чтобы при необходимости полностью покрыть кусочки геля. Инкубировать образцы на ночь при 37 градусах по Цельсию. Для выполнения пептидной экстракции тщательно вымойте извлеченный пептидный раствор из трубок и перенесите на чистые микротрубки.
Высушите супернатант в центробежном вакуумном испариворе. Добавьте 100 микролитров буфера извлечения в каждую трубку с кусочками геля и инкубировать в течение 30 минут при встряхивании. Пипетт супернатант в те же микротрубки, содержащие извлеченные пептиды в соответствии с их соответствующими полосами, и высыхают в вакуумной центрифуге.
Приступайте к анализу пептидной очистки и жидкой хроматографии-электроспрейной ионизации MS/MS, как описано в текстовом протоколе. Здесь изображено общее количество белков в образцах, извлеченных с каждым типом моющего средства. Самый высокий урожай пришел из тканей, извлеченных с буфером извлечения белка ткани, а затем DDM, CHAPS, ASB-14, и самый низкий выход из ACN и TFA.
Последовательно, общее количество выявленных белков были также самыми высокими в буфере извлечения белка ткани, извлеченных образца, и следовали той же тенденции, что и общий урожай. Здесь показано сравнение одноизменческих гелеобразных белковых профилей SPCA до и после того, как они подверглись оптимизированной подготовке и очистке образцов. В целом, высокая степень размазывания и плохое разделение белковых полос наблюдалось на третьей полосе.
Этот профиль показывает, что образцы могут содержать реагент экстракции, а также загрязняющие вещества, такие как липиды и клеточный мусор. Однако образцы SPCA, которые были разделены на супернатанты и гранулы, а затем подверглись оптимизированному протоколу, привели к образцовым одномерным профилям электрофорезов геля. Оптимизированный метод быстрого, надежного и эффективного извлечения белка из глазных микровесселей также может быть легко применен к другим образцам на основе тканей.
Здесь показаны белковые профили супернатанта и гранулы образцов мурина мозга и сердечной ткани. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы подвергать образцы для завершения гомогенизации, отделить супернатант от гранул, и удалить загрязняющие вещества и реагенты извлечения. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области экспериментальной и трансляционной офтальмологии, чтобы тщательно изучить протеом оскулярной сосудов с использованием свиных глаз в качестве модели.
