Возможность генерации различных подтипов моторных нейронов особенно актуальна для моделирования современных двигательных нейронных заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз. Этот метод позволяет приобретение клеточных популяций, которые являются очень жесткими для моторных нейронов со спинальной или черепной идентичности в короткие сроки и без шага очистки. Генерация двигательных нейронов человека из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток или iPSC при упрощенном состоянии культуры может облегчить скрининг препарата на заболевания моторных нейронов.
Неизгладимое выражение транскрипционного фактора программирования может быть использовано для создания других типов клеток, таких как нейрональные, скелетные мышцы и глиальные клетки из репозитория iPSC. Для генерации линии NIL и NIP iPSC смойте культуру iPSC человека без кальция и магния PBS перед лечением клеток реагентом диссоциации клеток в течение пяти-десяти минут при 37 градусах Цельсия. Когда клетки начали отделяться от контейнера культуры, используйте пипетку P1000, чтобы аккуратно вручную отмежевать клетки три-четыре раза.
Перенесите клетки в 15 миллилитровую трубку и довнесите конечный объем до 10 миллилитров со свежим PBS без кальция и магния для подсчета. Соберите один раз от 10 до шестой клеток путем центрифугации и повторного перерасхода гранул в 100 микролитров буфера R из электропорации комплекта. Добавьте 4,5 микрограмма транспонируемой векторной плазменной ДНК и 0,5 микрограмма плазменной ДНК piggyBacbac для трансфекции.
Трансфект с системой электропорации клеток в соответствии с инструкциями производителя с указанными параметрами. Затем семя клеток в среде iPSC человека дополняется 10 микромоляных ROCK ингибитор Y-27632 в шестимиллиметровой матрицы покрытием блюдо. Через два дня после трансфекции добавьте 5 микрограммов на миллилитр блацитина в культурную среду, удерживая клетки в антибиотике, по крайней мере, семь-десять дней, чтобы противостоятьберу клеток, которые не интегрировали трансгены.
В конце инкубации, поддерживать стабилико трансфицированных клеток, как смешанная популяция состоит из клеток с различным количеством трансгенов и различных мест интеграции или изолировать одного клона. Подготовка дополнительного блюда, чтобы эффективное выражение трансгенов на один микрограмм на миллилитр доксициклина индукции должны быть оценены RT-PCR с трансген-специфических грунтовок для нейрогенина-2, как описано ранее. На данном этапе запасы новых линий NIL и NIP iPSC также должны быть заморожены в условиях замораживания для человеческих iPSCs.
Для дифференциации моторных нейронов, разобщить стабилико трансфицированных клеточных культур с диссоциации реагент, как попродемонстрировано, чтобы клетки должны быть собраны в 15 миллилитров трубки, содержащей пять томов DMEM / F12 среды. После центрифугации, повторное использование клеток в среде iPSC человека дополняется ингибитором микромоляра ROCK для подсчета. Семя клеток на матричном покрытием блюда в 6,25 раза 10 четвертых клеток на сантиметр квадратной плотности.
В течение следующих двух дней, заменить supernatants со свежей дифференциации среды дополняется доксициклина. На второй день, изменить средний на нейробазальный B27 среды дополняется ингибитор гамма-секретазы, сосудистого эндотелиального фактора роста рецепторов ингибитор, и доксицилин. На пятый день отмежевать клетки, как это было продемонстрировано, и повторно изласыть отдельные клетки в четырех миллилитров DMEM/F12 среды для подсчета.
Трубопровод имеет важное значение для полной диссоциации клеток. Заморозить алицит прародителей моторных нейронов в среде замораживания клеток в соответствии с инструкциями производителя и собрать остальные клетки центрифугации. Повторное использование гранул в нейронной среде, дополненной 10 микромоляным ингибитором ROCK.
Семя клеток на полиорнитин ламинин покрытием микросвидовод поддерживает с полимерной крышкой скользит в один раз от 10 до пятой клетки на сантиметр квадратной плотности. На шестой день тщательно замените среду свежей нейронной средой без ингибитора культуры до анализа ниже по течению, не отделяя клетки от опорной поверхности. Равномерное выражение плюрипотентности маркера октамера связывания транскрипции фактор четыре или OTC4 можно наблюдать в дифференциации клеточных культур на нулевой день в отсутствие пан нейронального маркера нейрон-специфический класс три бета-тубулина TUJ1 положительность.
На третий день наблюдается сильное уменьшение количества OCT4-положительных клеток. Это отражается выражением TUJ1 в подмножестве дифференциации iPSCs. На пятый день, нет выражения OCT4 наблюдается в популяции, которая показывает последовательное выражение TUJ1 и приобретенных нейрональной морфологии.
Иммуностимулирование анализа семь дней после replating двигательных нейронных клеток-предшественников показывает равномерное выражение TUJ1 и зрелый маркер моторного нейрона холина ацетилтрансферазы. Нейроны, полученные iPSC NIL, успешно отображают зависящие от напряжения токи натрия и зависящие от напряжения калийные токи. 80% моторных нейронов, полученных из iPSC NIL, зажатых в текущей модальности зажима, способны вызвать скачки поездов при введении с текущим импульсом плюс 60 пикоамперов или более.
Минимальный ток, необходимый для получения повторяющихся стрельбы в более чем 50% зарегистрированных клеток плюс 40 пикоамперов с порогом всплеска около минус 38 милливольт и средней частотой стрельбы на плюс 40 пикоампов около восьми герц, предполагая, что iPSC NIL-производные спинномозговых моторных нейронов обладают функциональными свойствами, типичными для зрелых нейронов. Спинномозговые и черепные моторные нейроны могут быть получены из контролируемых iPSCs или iPSCs проведения патологических мутаций, и что эти клетки могут быть использованы в качестве моделей диссертаций или для скрининга наркотиков. Наш метод может быть использован, чтобы помочь в понимании того, почему различные двигательные нейронные единицы дифференциально зависит от ALS.
