Наш протокол позволяет получить уникальную информацию о молекулярных и объемных тканевых механизмах васкулогенеза, которые могут помочь в инженерной функциональной сосудотерапии сердечно-сосудистых заболеваний в моделировании. Этот протокол позволяет создавать надежные трехмерные сосудистые сети для оценки васкулогенного потенциала различных платформ, а также обеспечивает бесплатный вычислительный конвейер с открытым исходным кодом для анализа конечной топологии сети. Начните с добавления 250 микролитров раствора клеточного отслоения на колодец дифференцированной клеточной культуры D5D6 в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия.
В конце инкубации используйте наконечник пипетки P1000, чтобы разобщить клетки на одноклеточные суспензии. Бассейн клеточных растворов в одной 15 миллилитровой конической трубки для центрифугации. Мы приостанавливаем гранулы в 200 микролитров буфера сортировки ледяного холода и маркировать клетки пятью микролитров концентрированной флуоресценции конъюгированных антител CD34 в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.
В конце инкубации, мыть клетки в пяти mililitres ледяной сортировки буфера. Фильтр подвески через 40 микрометров залить ситечко в пять миллилитров флуоресценции активированной сортировки клеток, или FACS, трубки. Перед запуском образца, сортировать один раз 10 из четвертого неоцеливых клеток на флуоцитометре, gating области с высокой интенсивностью флуоресценции, которая не содержит ни одного из неотсебляющих клеток, чтобы служить в качестве отрицательного контроля.
Затем сортировать помеченный образец содержат эндотелиальные прародители, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток на основе их высокого экспрессии CD34. В конце сортировки перенесите эндотелиальные клетки-предшественники в микроцентрифугную трубку для центрифугации. Для инкапсуляции коллагена гидрогеля клеток-предшественников мы приостанавливаем сортированную клеточной гранулу в 200 микролитров эндотелиального роста Medium 2, дополненную 10 микромилитером ингибитора ROCK Y-27632.
Добавьте клетки к 400 микролитров посевной среды в 1,8-мильной микроцентрифугной трубке на льду. Смешайте 350 микролитров коллагена в клеточной подвеске. Раствор станет бледно-желтым.
Затем смешайте десять микролитров гидроксида натрия 1-Muller в коллаген и клеточный раствор. Теперь раствор станет ярко-розовым. Pipette 56 микролитров этого нейтрализованного раствора коллагеновых клеток в отдельных скважинах 96 хорошо ультра-низкое вложение U-нижней пластины культуры клеток для 30-минутной инкубации при 37 градусах по Цельсию.
В конце инкубации изучите скважины под ярким полевым микроскопом, чтобы проверить равномерное распределение клеток. Затем добавьте 100 микролитров свежеприготовленных эндотелиальных средств роста Medium 2, дополненных ингибитором ROCK и сосудистым эндотелиальным фактором роста к каждой пластине, и верните пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию. После одной недели культуры, добавить 250 микролитров 4%paraformaldehyde к одной колодец из 48 пластины хорошо на гидрогель и удалить среду из гидрогелей.
Затем используйте пинцет с тонкой наконечником для переноса гидрогелей в параформальдегид, содержащий скважины. После 10 минут при комнатной температуре, быстро мыть гидрогели с PBS и пронизывают 3-D культур с 250 микролитров 0,5% неионных сурфактант в течение пяти минут при комнатной температуре. Вымойте гидрогели двумя пятиминутными мойки при комнатной температуре с 250 микролитров PBS, дополненный 300 миллилитровглицина на стирку, а затем погружение каждого гидрогеля в 250 микролитров блокирующего буфера в течение 30 минут при комнатной температуре.
Этикетка клеток с соответствующими первичными антителами разбавленной в блокировании буфера на ночь при четырех градусах по Цельсию, а затем два моет в 0,5%эмульгирующих реагент и PBS Дульбекко. После второй стирки, этикетки клеток с соответствующим видом конкретных вторичных антител в течение двух часов при комнатной температуре защищены от света, перед мытьем 3-D культур два раза в 0,5%эмульгации реагента и PBS Дульбекко, как попродемонстрировано. Чтобы визуализировать ядра клеток, добавьте DAPI, разбавленный при концентрации от одного до 10000 в PBS к образцам в течение двух минут инкубации при комнатной температуре, а затем два моет в 0,5%эмульгации реагента и PBS Дульбекко.
Затем используйте пинцет с тонкой наконечником, чтобы передать каждый образец соответствующему смотровому судну. После дифференциации, сортировки и инкапсуляции в коллагеновых гидрогелях, клетки, как правило, остаются округлыми в течение 24 часов, прежде чем прийти к миграции и сформировать начальные люмены. Примерно через шесть дней культуры, примитивное капиллярное сплетение будет видно в гидрогеле при просмотре с яркой микроскопией поля.
После изображения фиксированных, окрашенных, нагруженных клеток гидрогелями на конфокальцаторе, предварительно обработанные изображения преобразуются в скелет, который позволяет анализ общей длины и подключения сети. Крайне важно добавить антибиотики после FACS, как стерилизация интерьера этого инструмента трудно, и удалить антибиотики 24 часов после инкапсуляции клеток. Используя этот метод, мы смогли определить, какие физические и химические характеристики внеклеточной матрицы, имитирующие биоматериалы, регулируют васкулогенный потенциал производных эндотелитарных прародителей iPSC.
