Этот метод полезен для того, чтобы проанализировать роль некоторых молекул в аксональной наведении и нейрональной миграции при развитии нервной системы. Основным преимуществом этой методики является то, что анализ результатов быстрый и простой и не требует сложного программного обеспечения, которое подразумевало бы большую подготовку исследователей. Демонстрация процедуры будет Мириан Сегура-Фелиу, техник из нашей лаборатории и я.
Чтобы начать пластины 200000 COS-1 клетки в 35 миллиметров Петри блюда и инкубировать с полной среде культуры в инкубаторе клеточной культуры для того, чтобы прочитать от 70 до 80% слияния в одночасье. На следующий день, чтобы заразить COS-1 клетки с ДНК кодирования молекулы кандидата с помощью липосомы на основе метода трансфекции. Сначала смешайте 250 микролитров свободной среды сыворотки и от одного до 2 микрограммов ДНК в 1,5 миллилитрной центрифуге трубки и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут.
Для приготовления липосомальной трубки добавьте 240 микролитров сыворотки свободной среды и 10 микролитров липосомального трансинфекционных реагентов и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. После инкубации добавьте содержимое трубки ДНК в губчатую трубку. Аккуратно перемешайте и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут.
Замените среду на культурные клетки 1,5 миллилитров свободной среды сыворотки. Добавить липосомы ДНК смесь медленно и падение мудрым в клетки. Инкубировать в инкубаторе культуры двуокиси углерода в течение трех часов.
После завершения инкубации замените носитель на полную культурную среду и инкубировать на ночь в инкубаторе. На следующий день, промыть клетки с 0,1 моляр Дулбекко PBS. Добавьте 800 микролитров трипсина EDTA на каждое блюдо и инкубировать в течение пяти-15 минут в инкубаторе двуокиси углерода.
Соберите отдельные клетки с двумя миллилитров полной среды культуры в 15 миллилитровую центрифугу трубки и добавить 10 миллилитров той же среды. Центрифуга клетки при четырех градусах по Цельсию при 130 раз g в течение пяти минут. Удалите супернатант и сохраните гранулы, содержащие клетки COS-1 на льду.
После приготовления коллагеновой рабочей смеси добавьте от 100 до 150 микролитров коллагеновой смеси в гранулы трансфицированных клеток и аккуратно перемешайте, трубя вверх и вниз. Распространение от 45 до 50 микролитров смеси гранул коллагеновых клеток на 35-миллиметровую чашку Петри, чтобы сформировать единую полосу коллагеновых клеток, примерно от одного до 1,5 сантиметров в длину. Поместите блюдо в инкубатор при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газели до тех пор, пока не будет наблюдаться гелеобразование.
Подготовь вторую полоску, содержащую контрольные клетки, во втором блюде культуры и поместите ее в инкубатор. Когда геляция завершена, добавить три-четыре миллилитров 37 градусов по Цельсию нагревается COS-1 полной культуры среды для каждого блюда, содержащего гелеобразные полоски коллагеновых клеток и поместить их в инкубатор. Используйте тонкий скальпель или измельчитель тканей, чтобы сократить полоски коллагеновых клеток для генерации небольших квадратных кусочков, от 400 до 500 микрометров в длину.
Перенесите все секции из одного и того же состояния трансфекции в чашку Петри, содержащую от трех до 3,5 миллилитров нейрональных средств культуры. Проверьте под рассечением микроскопа качество кусочков и поместите посуду в инкубатор. Используйте ножницы, чтобы вырезать рога эмбриона на эмбриональный день 16,5 из брюшной полости принесенной в жертву беременной самки крысы и поместить их в большую чашку Петри, содержащую холодный буфер HBSSg.
Поместите блюдо в капюшон ламинарного потока и использовать прямые типсы для извлечения эмбрионов и поместить их в новое блюдо, содержащее холодный HBBSg. С помощью небольших типсов, удалить кожу, а затем с изогнутыми и прямыми типсами, тщательно вскрыть мозг и поместить в блюдо, содержащее холодный HBSSg. Под рассечением микроскопа, используя скальпель или тонкие ножницы, разрезать мозг пополам вдоль средней линии, чтобы отделить оба полушария.
Затем удалите диэнцефалон и с тонкой тиской, удалить опоясывания и кровеносные сосуды из частей мозга. Используйте 100% этанола для очистки всех частей ткани измельчитель, особенно PTFE резки пластины и лезвие бритвы и сохранить ткани измельчитель в ламинарный поток капот под ультрафиолетовым освещением в течение 15 минут. Перенесите каждый кусок ткани на режущей пластины вертолета ткани.
После того, как ткань будет измельчена, перенесите кусочки из 35-миллиметровых чашек Петри, наполненных тремя-четырьмя миллилитров полного NCM. Используя тонкие иглы вольфрама, закончить рассечение ткани в полном NCM. Проверьте качество полученных ломтиков под рассечением микроскопа, убедившись, что слои четко идентифицируются в темном поле оптики и вскрыть область интереса с вольфрамовых игл.
Держите хорошее качество штук в полной NCM среды в инкубаторе двуокиси углерода. Визуальная демонстрация имеет решающее значение в шагах, связанных с подготовкой совместно культур, что облегчает слова, чтобы понять процесс. Поместите несколько стерильных четырех пластин культуры хорошо в капюшоне ламинарного потока и подготовить коллагеновую рабочую смесь, как раньше.
Добавьте от 15 до 20 микролитров смеси гидрогеля в дно каждой системы, чтобы создать круглую коллагеновую основу. Поместите посуду в инкубатор до полного геля. И проверить качество гелеобразного коллагена.
С пипеткой, передать небольшой кусок COS-1 клеточного агрегата на гидрогель базы, а затем использовать пипетку, чтобы поместить кусок ткани на том же основании, близко к части клеток агрегата на расстоянии одного explant размера. После подготовки новой рабочей смеси коллагена на льду, мягко пипетки от 15 до 20 микролитров этой новой смеси для покрытия explant и клеточного агрегата, что делает бутерброд, как гидрогель культуры. Используйте тонкую вольфрамовую иглу для переориентации экспланта, чтобы она столкнулась с агрегатом клеток на уровне от 500 до 600 микрометров.
Верните пластину в инкубатор до тех пор, пока не будет наблюдаться гелеобразование, а затем добавьте 0,5 миллилитров полного NCM, дополненного добавкой 2%B27, и держите культуры в течение 36-48 часов в инкубаторе. Когда гиппокамп аксоны столкнулись с Netrin-1, они росли преимущественно к источнику Netrin-1, указывая, что Netrin-1 действует как химио привлекательная молекула для этих аксонов. В состоянии контроля, или макет трансфекции, все аксоны росли радиально, без каких-либо направленных предпочтений.
Когда гиппокамп аксоны столкнулись с Sema3E секретирования клеток, большинство из них выросли напротив клеточного агрегата, что свидетельствует о том, что Sema3E действует как химиотерапия отталкивающей молекулы для этих аксонов. Это схематическое представление метода аксональной реакции и количественной оценки показывает, что в условиях контроля аксоны были равномерно распределены как в проксимальных, так и в дистальных квадрантах, показанных с радиальными нарой. Это указывает на проксимальное дистальное или PD соотношение одного.
Когда экспланты показали увеличение количества аксонов в проксимальной квадранте по сравнению с дисталом, что указывает на привлекательность химиотерапии, коэффициент PD был больше, чем один. Когда количество аксонов было выше в дизоранте, чем в проксимальной, что указывает на отталкивание химиотерапии, коэффициент PD был меньше, чем один. Следуя этому методу, исследователи могут получить важную информацию о роли некоторых молекул во время развития нейронов, что позволяет нам установить отправную точку для дальнейшего изучения функций.
Хотя этот метод полезен в развитии нейронов, как это, он также может быть применен в фармакологическом скрининге, ангиогенез, и тканевой инженерии в качестве стратегий.
