Этот метод электронной микроскопии объема используется для выполнения биологических исследований, которые требуют наблюдения 3-D структуры. Предлагая стержень, fielder зрения, и образец хранения до изображения пересдачи. Fx2 Asan спроектировал этапы пути, которые катализировали деабилацию для увеличения электронного испытания целевых структур и могут быть использованы для определения конкретной цели, представляющие интерес.
Эти частицы сочетают в себе использование метода коррелативного света и 3-D электронной микроскопии для исследования взаимодействий между membranous organelles и клетками-хозяинами. Через 16-24 часа после трансфекции аккуратно промыте культуру 250 микролитров раствором фиксации 30-37 градусов по Цельсию. Быстро заменить стирку 1,5 миллилитров свежего раствора фиксации, и размещение культуры на льду в течение 30 минут.
В конце инкубации, промыть клетки с тремя десять минут моет в один миллилитр ледяной 0,1 молярного буфера какодилата натрия на стирку. После последней стирки добавьте один миллилитр ледяного 0 до 4 градусов по Цельсию 20 миллимолярный раствор глицина в блюдо для десятиминутной инкубации на льду, а затем три пять минут моет с одним миллилитром свежего, холодного 0,1 молярного буфера какодилата натрия за стирку. Затем наклеить на клетки 500 микролитров свежеприготовленного раствора DAB.
И инкубировать клетки на льду в течение примерно пяти-сорока пяти минут. Когда светло-коричневое пятно видно под перевернутым световым микроскопом, промыть клетки три раза с одним миллилитр свежего, холодного 0,1 молярного буфера какодилата натрия в течение десяти минут за стирку. Затем используйте перевернутый инвертированный микроскоп фазового контраста, чтобы визуализировать окрашивание DAB при 100-м увеличении или выше и пометить дно стекла, где находится область интереса.
Для подготовки образца блока электронного микроскопа, сперва post-fix клетки с одним миллилитром 2%уменьшенного тетроксида осмия на один час на 4 градусах Celsius. В конце фиксации, промыть клетки с тремя пятиминутные моет и один миллилитр свежей дистиллированной воды на стирку. Перед лечением клеток одним миллилитром фильтрованного раствора TCH в течение 20 минут.
В конце инкубации, мыть клетки три раза в дистиллированной воде, как только что продемонстрировали и исправить клетки с 30-минутной инкубации в 2%снижение тетроксида осмия. В конце второй фиксации, мыть клетки три раза дистиллированной водой и покрыть культуру с одним миллилитр aqueous 1%уранил ацетат ночь при 4 градусах цельсия защищены от света. На следующее утро, мыть клетки три раза с дистиллированной водой, прежде чем окрашивание с одним миллилитр 60 градусов по Цельсию нагревается Уолтон свинца аспартатный раствор в течение 30 минут в духовке 60 градусов по Цельсию.
В конце инкубации, мыть клетки три раза в дистиллированной воде. И инкубировать культуру в градуированных серии 20-минутный 2 миллилитров этанола aliquots. После последнего 100%-ного воздействия этанола, инкубировать клетки в течение 30 минут в один миллилитр из трех до одного этанола с низкой вязкостью встраивания смеси среды при комнатной температуре.
В конце инкубации замените среду одним миллилитром этанола один к одному до низкой вязкости, встраивая смесь среды еще на 30 минут инкубации при комнатной температуре. Затем замените средний с одним миллилтером от одного до трех этанола на низкой вязкости встраивания смеси среды в течение дополнительных 30 минут при комнатной температуре. Затем замените среду одним миллилитром 100%-низкой вязкости, встраивая среду на ночь, а затем встраивая образец в 100%low viscosity встраивая смесь в течение 24 часов при 60 градусах Цельсия.
Для анализа электронной микроскопии передачи, на следующий день, используйте ультра микротом для получения 90 нанометров толщиной разделов и наблюдать сетки под передачей электронной микроскопии на 200 киловольт. Перед началом подготовки образца, чистый оксид олова indium покрытые стеклянные крышки с нежным возбуждением в изопропанол в течение 30 до 60 секунд. В конце агитации слейте лишний алкоголь и поместите крышки в безпыслятую среду.
Когда крышки сухие, используйте плазменный вешалка, чтобы светиться разряда coverslips в течение одной минуты. Затем вставьте крышки в держатель субстрата и поместите держатель субстрата в нож лодки. Чтобы получить образцы для сканирования электронной микроскопии, вставьте встроенный блок образца в образец держателя ультрамикротома.
И установите держатель в блок обрезки. Используйте лезвие бритвы, чтобы обрезать избыток смолы вокруг целевого положения, так что лицо блока приобретает трапециевидную или прямоугольную форму. Ведущие и задние края должны быть строго параллельны друг другу.
Нелегко приобрести большое количество серийных секций. Тем не менее, вы должны иметь ведущие края и задние края полностью параллельно. Затем вставьте держатель образца в руку ультрамикротома.
Поместите алмазный нож в держатель ножа, и заполнить нож лодку с фильтрованной дистиллированной водой. Затем осторожно нажмите на ручку держателя, чтобы настроить положение носителя так, чтобы край крышки был близок к ножу. После получения образца, остановить процесс секционирования, медленно открыть зажим винт трубки и слить воду лодки.
Когда процесс сбора лент будет завершен, удалите субстрат с помощью ручки зажима устройства и высушите ленту. Использование генетически помеченных плазмидов, выражаюющих интерес белков, позволяет идентифицировать трансфицированные клетки-мишени после окрашивания для помеченных белков. Коррелятивная световая электронная микроскопия может быть использована для дальнейшей визуализации обозначенной клеточной культуры.
Например, темное пятно, генерируемое SCO1-APEX2, наблюдается исключительно в митохондриальном пространстве, а не в матричном пространстве митохондрий. Код трансфицированных клеток с обеих SCO1-APEX2 и HRP-KDEL плазмиды выражают очень плотный электронный сигнал в митохондриальном пространстве интермембрана и эндоплазмической цитикулум. Тем не менее, эндоплазмическое окрашивание стикулум не наблюдается в клетках, которые трансфицированы только SCO1-APEX2.
Для серийной визуализации путем сканирования электронной микроскопии создается обзор всего массива изображения с помощью детектора электронов backscatter на большой площади. Далее, область интереса помещается в первом разделе и распространяется на все другие разделы. Наконец, область интереса, содержащая пять целевых ячеек, изображена с пятью нанометровых пикселей.
Увеличение показывает подробные субклеточные структуры, такие как аппарат Голги, митохондрии и эндполасмная ритикулум. Серийная визуализация ясно показывает, что эндоплазмические контакты ритулум-митохондрий происходят на разных z-самолетах. Вы должны иметь хорошее понимание того, как найти конкретную целевую структуру с помощью коррелятивного света и электронной микроскопии для исследования последствий конкретной модификации идентичности.
Эти методы окрашивания в сочетании с объемом электронной микроскопии могут быть использованы для более масштабного EM для исследования клеточных взаимодействий, особенно в евровирусе. Помните, глутаралдегид, а также энтетероцид и TCH очень токсичны, так что не забудьте носить защитную одежду и работать в дым капот при использовании этих материалов.
