Наш протокол позволяет зафиксировать генетическую связь между первичными и метастатическими поражениями путем выявления молекулярных изменений, связанных с прогрессированием заболевания. Наш метод дает возможность исследовать генетическую родственность в клиническом образце с высокой чувствительностью и специфичностью. Это связано с интеграцией молекулярного и гистопатологического анализа.
Оценка внутриопухолевая неоднородность в области исследований рака имеет первостепенное значение при разработке эффективных противоопухолевых стратегий, и наш метод широко применим ко многим типам твердых опухолей. После подготовки и количественной оценки библиотек, представляющих интерес, разбавить каждую библиотеку до 100 пикомолярной концентрации в нуклеазной воде и объединить 10 микролитров каждой разбавленной библиотеки для одного запуска в одной трубке. Затем смешайте объединенные библиотеки с помощью пипетки.
Чтобы инициировать секвенирование запуска, сначала откройте браузер Torrent на компьютере, подключенном к системе секвенирования. Запланируйте новый запуск с использованием общего шаблона для выбранного приложения и под вкладкой комплектов выберите систему Ion Proton или систему Ion Gene Studio S5. Выберите соответствующий чип из меню высадки типа чипа и выберите библиотечный набор Ion AmpliSeq 2.0 из списка высадок библиотечного комплекта.
Выберите кнопку Ion Chef для набора шаблонов и выберите соответствующий комплект шеф-повара из списка отсечки комплекта шаблонов. Выберите соответствующий комплект секвенирования из меню секвенирования комплекта высадки и выберите Ion Express из списка высадок штрих-кодов. Под вкладкой плагина выберите плагин анализа покрытия.
В соответствии с вкладкой плана выберите геном GRCH37HG19 из списка отсева справочной библиотеки. Из списка отсеек целевых регионов выберите соответствующую панель, которая будет секвенирована. Затем установите количество штрих-кодов, которые будут секвенированы, и установите имя штрих-кода и имя образца для каждой библиотеки.
Для разбавления объединенных библиотек разбавить фондовую библиотеку водой без нуклеазы до 25 пикомолярной концентрации для ионного протонного чипа и пипетки 50 микролитров каждой разбавленной библиотеки на дно соответствующей библиотеки образца трубки. Загрузите пробные трубки, содержащие объединенные разбавленные библиотеки, в систему подготовки библиотек и начните клоническое усиление. Для последовательности следующего поколения следуйте инструкциям на экране для инициализации инструмента.
Когда клоническое усиление будет закончено, откройте дверь инструмента Ion Chef, затем откройте крышку центрифуги загрузки чипа и удалите две фишки из системы подготовки библиотеки. Поместите чипы в отдельные контейнеры для хранения чипов и загрузите одну из микросхем в отсек чипа в приборе. Затем закройте крышку чипового отсека и начните секвенирование.
Для анализа мутаций откройте плагин анализа покрытия и используйте результаты анализа покрытия для проверки глубины охвата и единообразия. Используйте плагин Torrent Variant Caller для выполнения варианта вызова выбора зародышевой линии или соматический рабочий процесс по мере необходимости. Затем загрузите фильтрованные варианты вариантов файлов формата вызова и используйте программное обеспечение предиктора эффекта варианта в базе данных NCBI RefSeq, чтобы аннотировать варианты.
Чтобы оценить вариации копий-числа, используйте плагин загрузчик ионных репортеров для загрузки данных секвенирования в программное обеспечение ионных репортеров и использовать всеобъемлющий рабочий процесс опухоли панели рака нормальной пары для анализа данных. Вручную фильтруйте мутации и вариации копий на основе баллов, назначенных программным обеспечением, и проверяйте вариации визуально с помощью интегративного зрителя геномики. Затем визуально проинспектируйте выравнивание для необычных считываний, которые могут генерировать артефактные вызовы и проверить нормализованное покрытие для всех ампликонов через данный ген против нормализованного покрытия базового уровня для проверки вариаций числа копий.
Для каждого случая, индекс мутации звонки от секвенирования нормальной ткани или крови или первичной опухоли или метастазов. Пометить как зародыш линии и отказаться звонки, которые также очевидны из секвенирования данных зародышевой линии ДНК. Пометить в качестве клона или основателя мутации, которые разделяются между всеми поражениями данного пациента.
Затем пометить в качестве субклонального или прогрессора мутации, которые обнаруживаются в некоторых, но не все поражения данного пациента. В этом репрезентативном эксперименте секвенирование нескольких поражений пяти твердых псевдопапилярных неоплазмных случаев, направленных на кодирование последовательностей 409 генов, связанных с раком, выявило в общей сложности 27 соматических мутаций в восьми генах. Мутации были определены как основатель или клональный, когда разделяют между всеми поражениями данного пациента и прогрессора или субклонального при обнаружении в некоторых, но не все поражения данного пациента.
Последовательно иммуногистохимическое окрашивание для бета-катенина и KMD6A было однородным среди разнообразных поражений случаев с мутациями соответствующих генов. Умеренное окрашивание KMD6A в мутировавших образцах предполагает, что генетическое изменение может изменить функцию, а не экспрессию белка. Потеря функции KMD6A в опухолях поджелудочной железы связана с регуляцией гипоксии маркера GLUT-1.
И соответственно, GLUT-1 был более выражен в случаях, несущих мутации KMD6A. Иммуногистохимия для BAP1 и TP53 подтвердила, что мутации в этих генах были субклональными. В этом виртуальном кариотипе репрезентативного случая, показывающего расположение, близость и статус числа копий измененных генов, анализ вариаций копий с использованием данных секвенирования выявил изменения во всех анализируемых образцах.
И в отличие от точечных мутаций, большинство изменений вариации копий были субклональными. Проверка и индексация мутаций и вариации копий и числа и использование опухоли нормальное сравнение ДНК имеют важное значение для избежания генерации артефактных вызовов, которые могли бы признать результаты недействительными. Эта процедура также может быть применена к исследованиям секвенирования всего генома, направленным на изучение всего генома для выявления мутаций между поражениями различных типов твердых опухолей.
В области исследований рака эти методы являются важнейшими инструментами для понимания биологии заболеваний с важными клиническими последствиями, направленными на разработку персонализированных и эффективных целевых методов лечения.
