Этот протокол описывает, как трансгенные личинки зебры могут быть использованы для обеспечения in vivo количественный анализ ксенотрансплантатной васкуляризации опухоли. Основным преимуществом этой техники по сравнению с предыдущими методами является то, что она позволяет следователю точно количественно вносить изменения в уровни ксенотрансплантатной васкуляризации. Ключевым шагом является обеспечение того, чтобы опухолевые клетки вводились правильно в личинки зебры, так что последующие шаги изображения и количественной оценки не скомпрометированы.
После выращивания и маркировки клеток В16-F1 флуоресцентным красителем начните готовить эмбрионы к имплантации. Заполните 35-миллиметровую тарелку 2%метилцеллюлозой в растворе Е3 до четверти объема блюда. Используя переносную пипетку, поместите около 50 ранее подготовленных трансгенных эмбрионов на метилцеллюлозу, минимизируя объем переноса раствора Е3.
Используя наконечник микрокапильярии пипетки, расположить эмбрионы так, что все они ориентированы вертикально с головой на вершину, хвосты на дно, и эмбрион с левой стороны вверх. Добавьте 50%ECM к ранее подготовленной клеточной грануле B16-F1, чтобы произвести смесь клеток в ECM в соотношении два к одному. Хорошо перемешать путем трубопроводов и перемешивания, и хранить смесь на льду.
Используйте микрокапильярный пипетку, чтобы занять от трех до 10 микролитров клеток. Аккуратно вставьте наконечник пипетки в ранее подготовленную микроинъекцию иглы, а затем выбросьте матричную смесь B16-F1 в конец иглы. Вставьте иглу в держатель иглы и наклоните под углом 45 градусов к блюду.
Используйте пинцет, чтобы сломать кончик иглы, чтобы сделать отверстие достаточно большим для клеток, которые будут извлечены из иглы, не сжимая клетки. Включите под давлением воздушный цилиндр, прикрепленный к инъекционной аппарате, а затем на мгновение включите инжектор в непрерывном режиме не более чем на одну секунду, чтобы подтолкнуть клетки к кончику иглы. Навекрет иглу к желтковому мешку эмбриона и протолкнете ее через желточный мешок в брюшном направлении до тех пор, пока кончик иглы не выйтёт из желткового мешка и не толкает эмбриональный эпидермис на брюшной стороне эмбриона, только задний к сердцу.
Тщательно и слегка нажмите кончик иглы вперед, пока он не создал небольшое пространство между эпидермисом и мембраной желточного мешка. Пульс инжектора, чтобы извлечь часть клеточной смеси в это перивителлиновое пространство. Внимательно посмотрите на размер, форму и расположение ксенотрансплантата при имплантации и соответствующим образом отрегулируйте количество пульса и положение иглы, чтобы обеспечить правильно имплантированный ксенотрансплантат.
Повторите импульсы до 500 до 800 клеток были введены в перивителлин пространстве, создавая видимый выпуклость, которая простирается по крайней мере половину пути вдоль нижней части желточного мешка. Удалите иглу из эмбриона. После введения всех эмбрионов, используйте микрокапильярии пипетки отзыв, чтобы подтолкнуть все эмбрионы вместе, так что они могут быть pipetted с как можно меньше метилцеллюлозы, как это возможно.
Перенесите эмбрионы в восстановительное блюдо, содержащее E3 с ПТУ и метиленовым синим цветом. Затем аккуратно пипетки E3 вокруг эмбрионов, чтобы вымыть их, а затем инкубировать при 34 градусов по Цельсию. Затем изображение эстетизированных эмбрионов с помощью конфокального микроскопа.
Используйте лазерный канал, подходящий для опухолевых клеток, чтобы определить объем, который будет изображен, что позволяет по крайней мере один или два оптических разделов по обе стороны от трансплантата. Используйте интервалы раздела, которые находятся на интервале около пяти микрометров друг от друга, чтобы создать стек. Используйте двухканайонную визуализацию для изображения кровеносных сосудов и ксенотрансплантата опухоли.
Изображение опухоли ксенотрансплантата и кровеносных сосудов для одной личинки, и повторить эти шаги для каждой личинки, которые будут изображены. Для начала с количественной оценки ангиогенной реакции на ксенотрансплантат зебры, передача ранее созданных конфокальных файлов изображения опухоли ксенотрансплантата в новую папку на 3D-анализ изображений программного обеспечения. Чтобы создать протокол тома опухоли для измерения объема ксенотрансплантата опухоли, перейдите на вкладку Измерения в верхнем меню окна, а затем из списка протоколов, который появляется перетащите протокол под названием Найти объекты в пространство, которое называется Перетащите Задачи здесь, чтобы сделать измерения.
После обеспечения того, чтобы этот протокол был установлен для измерения объектов в опухолевом канале, перетащите протоколы, названные Clip To ROIs, и сделайте roi From Population из списка протоколов в задачи drag Here To Make Measurements space, убедившись, что эти две команды применяются к объектам, идентифицированным объектам Find. Перед калибровкой параметров этого протокола перейдите в меню высадки над меткой Mode в левом верхнем левом верхнем слева от окна и выберите расширенный вид Фокуса. Отбирать неохуморные каналы в панели в крайнем правом, нажав черный круг под каждым каналом заголовок так, что только опухолевый канал можно увидеть.
Затем используйте инструмент Freehand в верхней части окна, чтобы нарисовать область интереса, или рентабельность инвестиций, вокруг всего объема опухоли. На панели ниже изображения выберите метку Summary, а затем установите параметр Отображения, чтобы показать два популяции. Чтобы откалибровать задачу «Найти объекты», нажмите на звездочку, чтобы открыть окно настроек.
Отрегулируйте порог с помощью интенсивности и определите нижний порог до тех пор, пока не будут выбраны только опухолевые клетки, а не фоновая флуоресценция. Определите минимальный размер объекта таким образом, чтобы измерялись только нетронутые ячейки, в отличие от более мелких элементов клеточного мусора, установив минимальный размер объекта в 100 кубических микрометров. Сохраните этот протокол как объем опухоли, нажав на вкладку Измерения в верхнем меню и нажав протокол сохранения.
Используйте те же настройки для измерения всех ксенотрансплантатов. Чтобы измерить объем ксенотрансплантата связанных кровеносных сосудов, создать новый протокол, переехав в верхнее меню, а затем нажав на вкладку измерения, а затем четкий протокол. Перетащите задачи Find Objects и Clip To ROIs в пространство, которое называется Задачи перетаскивания здесь, чтобы сделать измерения для этого протокола.
Убедитесь, что первая команда настроена для измерения объектов в канале кровеносных сосудов и что следующая команда будет применяться к объектам, идентифицированным первой командой. Затем отбирать каналы, не являемые сосудами, в крайне правом стекле, чтобы было видно только кровеносные сосуды. Определите настройки протокола объемов сосудов таким же образом, как и в ранее описанной протоколе Том опухоли, и сохраните этот протокол как объем судна.
Очистить протокол, и сделать рентабельность инвестиций вокруг ксенотрансплантата, заботясь, чтобы не включать любые неохуморные аутофторесценции. Чтобы измерить объем объектов в опухолевом канале внутри этой рентабельности инвестиций, нажмите на вкладку Измерения, выберите команду Протокола Восстановления, выберите протокол тома опухоли и нажмите Восстановление. Используя новую рентабельность инвестиций, сделанную протоколом Объем опухоли, нажмите на вкладку Измерения и выберите команду Протокола Восстановления, выберите протокол объема судна и нажмите на строку суммы, чтобы рассчитать общий объем объектов в канале судна внутри этой рентабельности инвестиций.
Разделите объем сосуда на объем опухоли и умножьте ответ на 100, чтобы получить процентную стоимость трансплантации васкуляризации. С помощью изображения индивидуального ксенотрансплантата в шесть, 24 и 48 часов после имплантации, ангиогенная реакция в разных точках времени может быть рассчитана, с самой большой ангиогенной реакции между 24 до 48 часов после имплантации и максимальные уровни трансплантации васкуляризации видели около 48 часов. Конфокальные покадровые изображения Ксенотрансплантата B16-F1, имплантированного в двух дней после оплодотворения эмбриона зебры, показывают, что кровеносные сосуды с маркировкой GFP растут через ксенотрансплантат, образуя извилистую сеть с сосудами неправильного размера и морфологией, характерной для аномальной сосудистой сети, замеченной в опухолях млекопитающих.
Ксенотрансплантаты, инкубированные ингибитором VEGFR, показывают значительное снижение сосудов по сравнению с контрольными ксенотрансплантами, инкубированными в DMSO. В контрольных эмбрионах существовала обширная сосудистая сеть, растянувшейся по всей области ксенотрансплантата, типичная ангиогенная реакция, наблюдаемая после имплантации клеток B16-F1. При количественной оценке, ангиогенная реакция показывает явное снижение васкуляризации трансплантата в ингибитор-обработанных ксенотрансплантатах VEGFR по сравнению с контролем.
Опухолевый канал показывает массу клеток B16-F1 флуоресцентно помечены ниже желточного мешка, который отображает аутофторесценцию. Таким образом, рентабельность инвестиций должны быть тщательно нарисованы вокруг ксенотрансплантата, заботясь, чтобы не включать любой из аутофторесценции из желточного мешка. Протокол объема опухоли идентифицировал все клетки B16-F1 в рентабельности инвестиций, измерил их объем и обрезал рентабельность инвестиций до их объема.
Протокол объема опухолевых сосудов в этой новой обрезанной рентабельности позволил идентифицировать все сосуды, связанные с массой клеток B16-F1, и измерить их объем. Значения протоколов объема опухоли и объема опухолевых сосудов могут быть использованы для измерения васкуляризации трансплантата. Генетическая трактивность и проницаемость зебры позволяют исследование высоких сигнальных путей в ангиогенезе опухоли, и он также может выступать в качестве платформы скрининга для выявления антиангиогенных соединений.
