Эндоканнабиноиды являются сохраненными липидными посредниками, которые регулируют несколько биологических процессов в различных организмах. Первые обнаруженные эндоканнабиноиды анандамид и 2-arachidonoylglycerol, 2-AG. Нематод C.elegans является мощной моделью животных для изучения большого разнообразия биологических процессов.
Недавно мы обнаружили, что 2-AG играет основополагающую роль в регулировании оборота холестерина в C.elegans. Вот почему стало необходимо разработать и оптимизировать метод для изучения эндогенных 2-AG путем обнаружения и количественной оценки в C.elegans. Ранее сообщалось аналитические методы количественной оценки 2-AG в биологических образцах, как правило, связаны с использованием дейтетерированных стандартов, которые коммерчески приобрели необходимы, чтобы они доступны для покупки.
Тем не менее, они являются дорогостоящими, и из-за наличия нескольких двойных связей, чувствительны, чтобы окислиться с течением времени. Наиболее распространенная версия стандартов основана на октадеутерированной арахидоновой кислоте, пригодной для количественной оценки путем разбавления изотопов, жидкой хроматографии и спектроскопии задней массы. Для преодоления трудностей, связанных с стоимостью и стабильностью дейтетерированных стандартов для количественной оценки 2-AG, мы использовали удобный и простой метод для подготовки аналитического стандарта на основе дейтерия-5-глицерол.
Последовательность для подготовки pendeuterated стандарт требует трех этапов процедуры. Можно храниться в защищенном виде до тех пор, пока это не будет необходимо. Основная цель этой работы состоит в том, чтобы показать полный метод изучения 2-AG в C.elegans от синтеза аналитического дейтерированного стандарта до подготовки и извлечения образцов нематод и, наконец, анализа жидкой хроматографии и масс-спектроскопии.
Для получения deuterated 1-AG в качестве deuterated внутреннего стандарта для количественной оценки анализы следовать трехшаговому протоколу. Для того, чтобы защитить только первичные спирты, сначала добавьте 38 миллиграммов глицерола, обжигаемого до 10 миллилитров реакционной трубки с помощью трубы Pasteur и добавьте магнитный мешалку. Затем добавьте пять миллилитров ангидроуса DCM с помощью пяти миллилитров шприца Гамильтона и заполните трубку сухим азотом, чтобы создать инертную атмосферу.
Приготовьте ванну с помощью мелкой двойной колбы, наполненной дистиллированным этиловый ацетат. Заполните герметично закрытую реакционной трубку внутри ванны и охладите ее, медленно добавляя жидкий азот в этиловый ацетат до тех пор, пока растворитель не будет заморожен. Осторожно, жидкость сильно кипит при комнатной температуре и может вызвать сильные ожоги при контакте с глазами и кожей.
Затем добавьте 54 миллиграмма ангидроус-коллайдера с помощью шприца Гамильтона. Осторожно, коллайдин летучий и имеет очень сильный и неприятный запах. При 70 миллиграммах тербутил-диметил-цетилхлорида и перемешайте все в течение трех часов при температуре минус 78 градусов на магнитном мешалке.
Добавьте два миллилитров рассола, чтобы утолить реакцию. Извлекайте раствор двумя миллилитров дистиллированного дихлорметана три раза с помощью отдельной воронки, каждый раз сохраняя органические экстракты. Затем смешайте три органических экстракта и высушите сульфит натрия.
Очистить сырую смесь колонкой хроматографии с использованием кремнезема гель в качестве стационарной фазы и 10%увеличения гексана этил ацетат градиента, начиная со 100%гексана и заканчивая 100%этил ацетат. Для этого шага эстерификации, добавить 10 миллиграммов продукта ранее заявил 10 миллилитров реакционной трубки с помощью Пиппет Пастера и добавить магнитный мешалка. Добавьте два миллилитра ангидроуса DCM с помощью пяти миллилитров шприца Гамильтона и заполните трубку сухим азотом, чтобы создать инертную атмосферу.
Охладить раствор до нуля градусов с помощью ледяной ванны. Объявление 36 миллиграммов арахидоновой кислоты с использованием многотомной регулируемой микропипюты и перемешать. Затем добавьте 15 миллиграммов 40-метил-аминопиридин и перемешайте.
Добавьте 15 миллиграммов диакилпропилкарбодиимида с помощью многотомного регулируемого микропипта и перемешайте. Добавьте два миллилитров воды, чтобы утолить реакцию, а затем извлечь раствор с двумя миллилитров дистиллированной DCM три раза с помощью разделительной воронки. Комбинат три органических экстрактов и сухой над сульфитом натрия, очистить сырую смесь колонки хроматографии с использованием кремнезема гель в качестве стационарной фазы, то 10%увеличивая гексан этил ацетат градиент, начиная со 100% гексана и заканчивая 50 50%hexane этиловый ацетат.
Наконец, для шага депротекторизации добавьте 15 миллиграммов ранее синтезированного продукта в реакционной трубку 10 миллилитров с помощью пипетки Pasteur и добавьте магнитный мешалку. Добавьте два миллилитров тетрагидрофурана из ангидрогидрофурана с помощью пяти миллилитров шприца Гамильтона и заполните трубку сухим азотом, чтобы создать инертную атмосферу. Затем охладить раствор до нуля градусов с помощью ледяной ванны.
Добавьте 150 микролитров капельного раствора тетрабутиламмония в THF с помощью шприца Гамильтона. Через час добавьте два миллилитров воды, чтобы утолить реакцию. Извлекайте раствор с помощью двух миллилитров дистиллированной DCM три раза с помощью разделительной воронки.
Смешайте три органических экстракта и высушите сульфит натрия. Для процедуры отбеливания, поверните червей на посеянные шесть сантиметров NGM пластин. Разрешить червь расти от двух до трех дней, так что Есть много яиц и gravid взрослых на тарелке.
Если у вас есть много яиц и взрослых, залить пять миллилитров M9 на тарелку. Используя стеклянную пипетку, перенесите червей в 15 миллилитров соколиной трубки. Центрифуга трубки в течение двух минут на 2000 Г и гранулы червей.
Всасывание большую часть M9, не нарушая червя гранулы. Добавьте три миллилитров раствора отбеливания и смешайте раствор осторожно, инвертировать в течение примерно пяти минут или до тех пор, пока вы не увидите уменьшение числа нетронутых взрослых червей. После того, как большинство тел растворились, центрифуга на 2000 Г в течение одной минуты.
Всасывание большую часть раствора отбеливания, не нарушая червя гранулы. Добавьте 15 миллилитров M9 в трубку и хорошо перемешайте. Центрифуга снова на 2000 Г в течение одной минуты.
Всасывание большую часть M9, не нарушая червя гранулы. Для подготовки образца червя, пусть N2 эмбрионов, полученных путем отбеливания процедуры было в ночь в буфере M9 на 20 градусов. Затем, урожай синхронизированных L1s путем центрифугирования трубки две минуты на 2000 Г.Вымойте червей с буфером M9 еще раз и количественно количество живых L1. Семя примерно 10000 червей в NGM пластин с одним миллилитр OP 50 Escherichia coli ранее сушеные.
Инкубировать пластины по крайней мере в течение 48 часов при 20 градусах, пока черви не достигнут стадии L4. Урожай червей с помощью холодного буфера M9 в 50 миллилитров соколиной трубки. Вымойте их еще раз и передать их в 1,5 миллилитров трубки.
Пеллет червей центрифугации на 2000 Г в течение одной минуты. Устраните большую часть супернатанта. Затем погрузите трубку в жидкий азот и перемешайте при температуре минус 80 градусов.
Оттепель примерно 100 микролитров замороженных гранул червя принадлежащих N2, а затем добавить 1,3 миллилитров метанола. После этого, sonicate образец в течение четырех минут. После соника добавьте 1000 ppb внутреннего дейтератированного стандарта, 2,6 миллилитров хлороформа и 1,3 миллилитров 0,5 молара хлорида калия, 0,08 молара фосфорной кислоты к окончательному соотношению один к одному.
Vortex образцы в течение одной минуты, а затем sonicate их в ультразвуковой водяной бане в течение 15 минут на льду. Vortex образцы снова дважды в течение одной минуты и центрифугировать их в течение 10 минут на 2000 G, чтобы вызвать фазовое разделение. Соберите нижнюю фазу в чистую стеклянную трубку, высушите ее под азотом и повторно нарисуйте в 100 микролитров ацетонитрила.
Для успешной количественной оценки эндогенной 2-AG необходимо было синтезировать насыщенный аналог с помощью трехшагового метода. Затем он был добавлен в образцы червей, извлечены и проанализированы высокой производительности жидкой хроматографии, в сочетании с масс-спектрометрии. Используется в качестве внутреннего стандарта, синтетический дейтетерированный 1-AG был инструментом для количественной оценки эндогенного метаболита.
Метод был оптимизирован с помощью переходов для 2-AG и для дейтетерированных 1-AG, где молекулы глицерола теряются. 2-AG эндогенные из образцов C.elegans был успешно обнаружен и количественно изотопного разбавления с химически синтезированных дейтетеризированных 1-AG с использованием высокой производительности жидкой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрии. Первый образец был подготовлен с дейтетерированным стандартом 1-AG, в то время как второй образец без стандарта.
Поскольку первоначальная концентрация обнародуемого стандарта в выборке 1 и 3 составила 1000 ppb каждый, из пикового соотношения площади можно рассчитать эндогенную концентрацию 2-AG в выборке 340 ppb для образца 1 и 360 ppb для выборки 3, давая в среднем 350 ppb. Коэффициенты были рассчитаны как качество между пиковыми областями 2-AG и deuterated 1-AG, соответственно, для двух изолированных образцов. Оба с deuterated стандартом добавленным ранее к извлечению.
Учитывая недавно обнаруженное значение 2-AG в повышении оборота холестерина и отсутствие информации о том, как липиды влияют на этот процесс, необходимо надежный метод обнаружения этого эндоканнабиноида. Ключевым шагом этого протокола стало успешное развитие простого и надежного синтетического метода, о чем сообщалось здесь для получения дейтетерированного аналога 2-AG. Большинство зарегистрированных методов количественной оценки моноаклоглицелол связаны с использованием коммерчески доступных аналитических стандартов, которые, как правило, являются дорогостоящими и нестабильными в обычных условиях хранения, что делает их недоступными для лабораторий с более низким бюджетом.
Тем не менее, этот метод решает эту проблему, предлагая синтез стандарта с использованием более доступных стартовых материалов. Синтетический метод прямо вперед без сложных условий, необходимых, что делает его идеальным для ведения в любой лаборатории с минимальным оборудованием и доступ к реакционное, даже в сокращенном бюджете. Таким образом, эта новая процедура описывает прямой и воспроизводимый способ обнаружения и количественной оценки 2-AG, который поможет ответить на некоторые вопросы, поднятые после описания роли этих эндоканнабиноидов в торговле холестерином в C.elegans.
