Решетка световой микроскопии является мощной технологией визуализации, но лишь немногие лаборатории в мире способны использовать его. Этот протокол дает подробный обзор того, как использовать коммерчески доступные решетки светового листа микроскопа. Это чрезвычайно мощная система, способная четырехмерную визуализацию отдельных клеток или эмбрионов, которая позволяет отслеживать молекулы в режиме реального времени.
Основным преимуществом этой техники является то, что она может трехмерно изображение одной живой клетки или органов с высоким spatiotemporal разрешение и минимальное отбеливание фото. Решетчатый рисунок светового листа позволяет нам высокоскоростные образцы изображения и получить в режиме реального времени видео трехмерных живых клеток и органов с молекулярными деталями, что другие методы не могут достичь. Это первый видео-протокол, показывающий, как нам решетки светового листа микроскопии для изображения одной клетки четыре измерения.
Это очень сложный метод из-за выравнивания и подготовки образца. И мы считаем, что визуальная демонстрация улучшит доступность, позволяя больше ученых, чтобы изображение многих различных молекул, клеток и органов в биологии. Чтобы начать эту процедуру, инкубировать пять миллиметров круглых coverslips с 0,1%поли-L-лизин при комнатной температуре в течение 10 минут.
Аспирировать жидкость и пусть coverslips воздух сухой естественно. Затем добавьте три миллилитров градиента плотности в 15 миллилитров конической трубки. Аккуратно добавьте клетки дроп-мудрый к краю трубки.
Центрифуга при 930 раз g и при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. После этого тщательно удалите тонкий средний слой ячеек между полными средствами массовой информации и градиентным реагентом плотности, убедившись, что каждый тип клетки помещен в отдельную коническую трубку. Центрифуга при 300 раз g в течение пяти минут, чтобы вымыть клетки.
Отбросьте супернатант и добавьте пять миллилитров RPMI в трубки Т-клеток и клеток CH27. Повторите стирку со свежим RPMI до тех пор, пока не будут выполнены три общие стирки. Затем, повторного перерасхода клеток в каждой трубке с одним миллилитром полного RPMI и рассчитывать клетки с гемоцитометром.
Resuspend один миллион антиген-представляя клеток в 500 микролитров полного RPMI и добавить 10 микромолярной MCC. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом в течение трех часов. После этого, resuspend один миллион Т-клеток в 500 микролитров полного RPMI.
Добавьте два микрограмма анти-TCR бета Alexa 488 помечены FAB и инкубировать при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа в течение 30 минут. Далее центрифуга обе клетки по 300 раз г в течение пяти минут и отбросить супернатант. Добавьте 500 микролитров полного RPMI и повторите центрифугу для мытья клеток.
Повторите стирку со свежим RPMI до тех пор, пока три общей моет были выполнены отбрасывая supernatant после каждого мытья. После этого, resuspend обоих типов клеток в 500 микролитров изображений средств массовой информации. Во-первых, добавьте 10 миллилитров воды и 30 микролитров флуоресцента в ванну LLSM.
Нажмите Изображение Главная переместить объект в положение изображения и посмотреть на один бессель лазерного луча картины. Выровнять лазерный луч с помощью направляющей и заданной области интереса, чтобы сделать луч тонкий узор, который сбалансирован во всех направлениях. Луч должен также отображаться сосредоточены в камере finder.
Используйте два регулировки наклона зеркала, верхний микрометр фокусировки и объективный цвет для регулировки луча. Далее, мыть ванну и цели, по крайней мере 200 миллилитров воды, чтобы полностью удалить любой флуоресцейн. Чтобы изображение стандартных флуоресцентных бусин, включите дизер, установив до трех в поле диапазона Xgalvo и нажмите Live для просмотра текущего поля.
Вручную отрегулируйте зеркало наклона, объективный цвет и фокус-микрометр для наивысших серых значений. Затем отрегулируйте по мере необходимости, чтобы получить надлежащие шаблоны для объективного сканирования, галво, плюс объективные и режимы захвата образца сканирования. После этого нажмите Выполнить в режиме сканирования образца для сбора функции распространения тока образца для де-перекоса и де-свертки.
Измените лазеры на три цветовых режима и нажмите Выполнить снова. Для начала добавьте 100 000 противосердных ячеек к подготовленному пятимиллиметровому диаметру круговой крышки и дайте им осесть в течение 10 минут. Смазать держатель образца и добавить крышку к нему ячейки вверх.
Далее добавьте каплю средств визуализации в заднюю часть крышки. Винт держатель образца на Пьезо и нажмите Изображение Главная. Найдите ячейку, представляя антиген, для изображения и убедитесь, что llSM и программное обеспечение для визуализации функционируют должным образом.
Нажмите Live для просмотра текущего изображения. Двигайтесь вдоль q, чтобы найти крышку и ячейки. Найдите центр антиген-представляя клетки путем двигать в направлении, после этого отжимайте стоп для того чтобы приостановить лазер.
Проверьте 3D и ввемийте нужные настройки. Пресс-центр, а затем нажмите Execute для сбора данных. Опустите сцену в положение нагрузки и добавьте 50 микролитров Т-клеток и средств визуализации капли-мудрый непосредственно над крышкой.
Лучше всего, чтобы капля форме на конце кончика пипетки, а затем коснуться кончика в ванну жидкости. Поднимите сцену назад, нажав Image Return. Начните визуализацию.
Обязательно установите желаемый стек и длину таймлапса. Например, изображение 60 стеков при размере шага 0,4 микрометра и входные 500 таймфреймов. Прекратите запись до 500 кадров, чтобы избежать отбеливания фотографий.
Используйте режим в реальном времени для поиска пар ячеек, а когда будут введены готовые и желаемые настройки, нажмите Execute для сбора данных. В этом исследовании, первичные мыши 5CC7 Т-клеток изолированы и подготовлены, а затем изображены с помощью решетки световой лист микроскопа. Здесь показан правильный путь луча и выравнивание луча при изображении с флуорессейном.
Объективное сканирование должно показать большую форму X в проекциях X и Y, которая является как можно более симметричной. Они также должны быть скорректированы, чтобы быть как можно меньше X, как это возможно. Сканирование гальво должно показывать овал в X и XY с одной точкой с обеих сторон.
Наконец, как объективное сканирование, так и сканирование образца должны показывать точки, которые выглядят как можно более круглыми. Используя этот протокол, можно было увидеть четырехмерную динамику Т-клеточных рецепторов на поверхности Т-клеток. Основное преимущество этого микроскопа заключается в способности отслеживать визуализированные поверхностные единицы Т-клеточных рецепторов и получать количественные данные от их размера, движения, интенсивности сигнала и экскрементов.
Самое главное помнить, это качество вашего выравнивания. Решетчатый световой лист должен быть выровнен ежедневно, и не делать этого должным образом приведет к искаженной визуализации. Аналогичным образом, качество собранных PSF непосредственно влияет на качество свертки, что в конечном итоге приводит к качеству вашего конечного изображения.
Одна из причин, этот метод настолько мощным, потому что каждая клетка и этикетка могут быть заменены, чтобы визуализировать многие типы клеток и молекул. Таким образом, этот метод может быть использован для ответа на любой вопрос, связанный с четырехмерным отслеживанием молекул. Мы считаем, что этот метод проложит путь для исследователей, чтобы исследовать новые вопросы в области молекулярной торговли.
Он еще не широко используется из-за сложной системы, поэтому мы надеемся, что это видео Jove улучшит доступность техники. Лазеры, используемые в системе, являются классом 4, поэтому для обеспечения лазерной безопасности необходимо проявлять абсолютную осторожность. Пожалуйста, провести необходимую подготовку лазерной безопасности до использования этого метода.
