Моноклональные антитела доминируют на биофармацевтическом рынке и, как правило, очищаются хроматографией белка А. Согласно смолы является одним из основных драйверов затрат во время производства, влияющих на цену антител на основе терапии. Здесь мы описываем новый лиганд сродства на основе флуоресцентного белка, который читается как носитель линейного эпитопа нейтрализующих антитела 2F5.
В целом наш метод позволяет быстрое поколение сродства хроматографических смол, которые могут быть использованы для захвата моноклональных антител. Мы продемонстрировали эту способность, захватив антитела 2F5 из экстракта сырого растения. Мы оптимизировали условия захвата и буфер раствора для улучшения динамической емкости связывания и повторного использования смолы.
Наша смола позволяет, как правило, слабее условия, чем белок А и имеет потенциал, чтобы уменьшить затраты на очистку моноклональных антител. Кроме того, смола может быть легко адаптирована к другим антителам, которые связываются с линейными эпитопами. Чтобы начать эту процедуру, отрегулируйте концентрацию подготовленного раствора лиганда сродства так, чтобы он был в диапазоне от 5 до 15 граммов на литр, как это определено конструкцией экспериментов.
Храните раствор на льду до тех пор, пока не будет готова реакция соединения. Затем заполните один двухми миллилитровый шприц раствором DFE. И подготовить адаптер для установки шприцев на NHS-активированных перекрестных столбцов агарозы с объемом кровати одного миллилитра.
На каждые 10 столбцов, используемых для соединения, приготовьте 30 миллилитров раствора деактивации, 30 миллилитров раствора низкого рН и один миллилитр раствора для хранения. Затем приготовьте 20 миллилитров одной миллимолярной соляной кислоты в трубке. И инкубировать его на льду, по крайней мере 20 минут.
Подготовьте точность шкалы для мониторинга потока через фракции для всех шагов во время реакции соединения. После этого откройте запечатанную колонку агарозы, активированную ГСЗ. Нанесите каплю буфера на вход адаптера, чтобы предотвратить проникновение воздуха в столбец.
Намонтировать адаптер шприца на входе колонки. Вымойте колонку шестью миллилитров ледяной одной миллимолярной соляной кислоты, при скорости потока меньше, чем один миллилитр в минуту. Используя двухми миллилитровый шприц, немедленно ввимите 1,5 миллилитров раствора DFE со скоростью потока менее одного миллилитра в минуту.
И собирать поток через фракцию по точной шкале для последующего анализа. Печать колонны на обоих концах и инкубировать в течение 15 до 45 минут, при 22 градусах по Цельсию. Далее вводят шесть миллилитров раствора активации, за которыми следуют шесть миллилитров раствора низкого рН, при скорости потока менее одного миллилитра в минуту, удаляем из смолы нековалентно связанные лиганды.
Ввесите шесть миллилитров раствора активации и инкубировать столбец в течение 15 минут. После этого ввилите в колонку шесть миллилитров раствора низкого рН. Затем шесть миллилитров раствора активации.
Затем ввимит в колонку еще шесть миллилитров раствора низкого рН. Ввеси два миллилитров раствора для хранения в колонку и храните его при четырех градусах Цельсия. Сначала подготовь 100 миллилитров либо очищенного растительного экстракта, содержащего 2F5, либо супернатанта для предпочтительной клеточной системы выражения, которая также содержит 2F5.
Далее подготовьтесь к равновесию буфера и буфера иллюзии высокой прочности железа X, как указано в текстовом протоколе. Промыть хроматографическую систему буферами. Накреню столбец сродства DFE на хроматографической системе.
И эквилибрировать с пятью резюме эквилибрации буфера, со скоростью потока один миллилитр в минуту. Мониторинг поглощения УФ на 280 нанометров. Затем загрузите 80 миллилитров либо очищенного растительного экстракта, либо супернатанта на столбец со скоростью потока 5 миллилитров в минуту.
Чтобы гарантировать время контакта в две минуты. Соберите поток через образцы в двух миллилитров фракций или прорыв кривой реконструкции. Храните поток через образцы при четырех градусах по Цельсию, если немедленный анализ выборки не возможен.
После этого мыть столбец с 6CV эквилибрации буфера. Соберите образец в начале, середине и конце стирки. Разбавить MAB2F5 с пятью томами высокой ионной прочности иллюзионный буфер.
Соберите фракцию DFE, когда УФ-сигнал на 280 нанометров увеличился до пяти миллиа абсорбционных единиц выше базового уровня. Оптимизируйте буфер иллюзии для каждой пары эпитоп-антител, как указано в текстовом протоколе. Синтез белка DFE выражается в трансгенных табачных растениях, выращенных в теплице.
Общее восстановление DFE составляет 23,5 миллиграмма на килограмм. С чистотой более 90%Абсолютное количество DFE обездвижено на смоле увеличивается с массой DFE вводят в колонку, и плато около 15 граммов на литр, в то время как соединение выход снижается непрерывно, как больше DFE вводится. Молекулы DFE, как видно, сохраняют свою красную флуоресцентность, даже после соединения.
Интенсивность цвета соответствует общему количеству обездвижено DFE. Поэтому цвет столбца может быть использован в качестве простого параметра контроля качества для оценки эффективности соединения и качества столбца. Рекомбинантное антитело 2F5 преходяще произведено в заводах benthamiana Nicotiana выращенных в phytotron.
Улавливание 2F5 из экстракта сырого растения, проверяется с помощью столбцов сродства, в сочетании с приблизительно семью миллиграммами очищенного DFE. Концентрация хлорида магния 1,25 моляра достаточно, чтобы elute 2F5 из смолы сродства DFE с восстановлением близко к 100% и чистота примерно 97%, что сопоставимо с белка смолы. DBC смолы сродства DFE на 10%2F5 прорыв, снижается линейно в течение 25 циклов, около 15% от первоначального значения.
Мы использовали подход к экспериментам для оптимизации емкости соединения нашего лиганда сродства. Эти условия могут быть доработаны для других лигандов в будущем. Наш метод использует флуоресцентный белок, чтобы нить суб-носителя белка для продукта конкретных лиганд.
В то же время просто добавьте функции в качестве визуального индикатора качества мобилизационной процедуры, обеспечивая немедленную и интуитивную обратную связь с оператором.
