Анализ микробиоты с использованием двухступенчатого ПЦР и секвенирования гена нового поколения 16S rRNA

Профилирование микробиома является первым шагом на пути к определению роли микробиома в здоровье и болезнях. Здесь мы описываем простую процедуру изоляции высококачественной бактериальной ДНК из библиотеки подготовки фекальных образцов, выполняя РНК 16SR и мета геномное секвенирование и анализ данных микробиома. Этот протокол поможет исследователям, новым для микробиомного поля, а также исследователям, работающим в области микробиома, в создании трубопровода микробиома в их лаборатории. Этот протокол может быть расширен для профилирования микробиома из других био-образцов, таких как носовые, устные или образцы кожи животных и человека. Сбор бисера является наиболее важным шагом, как все шаги вниз по течению зависят от высокого качества ДНК. Правильное уплотнение пластины консерва имеет важное значение, поскольку неполное уплотнение может привести к угнетению усиленного продукта, что приведет к низкому качеству данных секвенирования. Для начала стерилизовать разделинные коробки с 70% этанола. Поместите мышей в стерилизованные ящики разделировок и дайте им нормально испражняться в течение одного часа. Используйте стерильные типсы для сбора фекальных гранул в пустой предварительно помеченной 1,5 миллилитровой микро центрифуге трубки. Заключите трубку надежно. Стерилизовать типсы с 70% этанола, а затем зародышевой одноразовой салфетки, после сбора фекальных с каждой мыши. Взвесить 200 миллиграммов фекальных гранул в 1,5 миллилитровую микро центрифугу, с 0,1 миллилитровыми стеклянными бусинками, и поместить бисерную трубку в однородный шарик и гомогенизировать образцы в течение 45 секунд при комнатной температуре со скоростью 4,5 метра в секунду. Извлекайте ДНК в соответствии с инструкциями производителя комплекта и elute ДНК в 1,5 миллилитров микро центрифуг трубки. После изоляции ДНК, количественно изолированной ДНК, загрузив 1 микролитер ДНК на флюорометр. Настройка 16S рибосомного гена РНК усиления PCR1 в 96-Ну ПЦР пластины, используя 25 микролитровый объем реакции. Используя многоканарновую пипетку, добавьте 40 нанограммов ДНК, 13,5 микролитров 2X высококачественной полимеразной ферментной смеси, содержащей буфер, плюс DNTPs вперед и пять грунтовки. Печать ПЦР пластины правильно сверху вниз по всем четырем краям. И центрифуга при 1000 раз G в 20