Количественная оценка конформационных изменений в отдельных биомолекулярах под потоком снофа полезна для понимания функции и биофизики макромолекул, таких как белок и ДНК. Микроскопия флуоресценции позволяет в режиме реального времени на месте визуализировать отдельные молекулы в условиях физиологического потока с высоким временным и пространственным разрешением. Это не имеет себе равных по другим методам, как AFM.
Характеризовав силу стрижки, под которой белки нашей ДНК имеют глобальные конформационные изменения, можно лучше разрабатывать препараты, имитирующие эти биофизические свойства. Этот протокол может быть широко применен для изучения поведения или других полимеров, особенно био полимеров, в различных условиях потока и для исследования реологии сложных жидкостей. Сроки шагов имеет решающее значение для успеха.
Мы предлагаем практиковать микрофлюидное устройство обработки поверхности и флуоресценции микроскопии шаги много раз, чтобы выполнить их эффективным способом. Захват конформациальных изменений в биомолекулах является визуальным и динамичным явлением, которое лучше всего рассматривать на пленке. Ученые лучше поймут этот метод, увидев в режиме реального времени белок и микроскопию ДНК, представленную в этом видео.
Чтобы подготовить микрофлюидное устройство, добавьте пять частей силиконовой базы еластомера к одной части лечебного агента в взвешенной лодке. и тщательно перемешать содержимое в течение одной минуты, чтобы создать предварительно вылеченное решение PDMS. Поместите мастер кремниевых пластин в пластиковой чашке Петри и залить PDMS раствор над пластиной, чтобы создать пятимиллиметровый слой.
Обложка блюдо и оставить его в desiccator под вакуумом в течение одного часа, чтобы удалить пузырьки воздуха. Затем инкубировать покрытые чашки Петри на 60 градусов по Цельсию на ночь, чтобы вылечить PDMS в гибкую твердую, что приведет к микрофлюидных каналов формируется в PDMS на интерфейс пластин PDMS. На следующий день используйте бритву, чтобы сократить 20 на 10 миллиметров прямоугольники вокруг каждого микрофлюидного канала в PDMS и удалить прямоугольные блоки с пинцетом.
Используйте 25-калибровочный тупой конец иглы с заточенными краями, чтобы пробить отверстие диаметром 0,5 миллиметра на одном конце канала, убедившись, что отверстие проходит полностью через блок PDMS. Используйте тонкую иглу, чтобы пробить PDMS из отверстия и повторить процесс на другом конце канала. Поместите блок PDMS с боковой стороной канала вверх и крышкой в камеру плазменной склеивания машины и начать лечение.
Когда лечение завершено, быстро поместите блок PDMS на крышку, так что канал находится в контакте с скольжения. Нанесите давление на края блока, затем поместите сборку крышки PDMS на горячую пластину при 115 градусах по Цельсию в течение 15 минут, чтобы укрепить постоянную связь. Наконец, вставьте 10-сантиметровую длину.
0,25 миллиметра трубки внутреннего диаметра в отверстие розетки в верхней части блока PDMS, чтобы жидкость легко вытекать из канала. Для фактора фон Виллебранда или экспериментов VWF вводят до 10 микролитров по 10 микрограмм на миллилитр BSA-Biotin, растворенный в стерильном 1X PBS, в вход микрофлюидного устройства. Утаить несколько микролитров BSA-Biotin в кончике пипетки после инъекции и позволить кончику оставаться встроенным в входе.
Разрешить BSA-Biotin инкубировать в устройстве в течение двух часов, что приведет к BSA не специально связывания с поверхностью крышки. Затем снимите наконечник пипетки и ввелите в канал до 10 микролитров раствора блокировки тактина. Разрешить рафин решение инкубировать в течение 30 минут, чтобы он может блокировать любые свободные сайты и уменьшить неспецифическое связывание биомолекул на поверхность.
Удалите наконечник и ввилите до 10 микролитров стрептавидина в стерильный PBS в канал, который будет связываться с биотин групп BSA-biotin. Затем ввимите до 10 микролитров моющего раствора, чтобы смыть лишний стрептавидин. Удалите наконечник и ввилите либо VWF в случае раствора или ДНК лямбды.
Инкубировать VWF в течение трех минут или ДНК лямбды в течение 45 минут. Затем ввисьйте пять миллимоляр свободного биотина, чтобы заблокировать избыток стрептавидина связывающих участков. Загрузите один миллилитр таксин, блокирующий раствор, в шприц и закрелите его в шприц-насосе.
Затем прикрепите один конец трубки к шприцу иглы и поток в растворе, чтобы удалить пузырьки воздуха. Примерно через три минуты после бесплатной инъекции биотина прикрепите другой конец трубки к входу микрофлюидного устройства. Выберите наивысшую цель увеличения TIRF или конфокального флуоресцентный микроскоп.
При необходимости добавьте каплю масла погружения на цель. Поместите микрофлюидное устройство на сцену микроскопа так, чтобы обложка была заподлицо с целью. Начните микроскопию яркого поля и отрегулируйте фокус так, чтобы были видны такие объекты, как мусор и пузыри.
Затем отрегулируйте сцену в направлениях X и Y до тех пор, пока не будет виден край микрофлюидного канала и не будет разделена на рамку. Переключитесь на канал FITC и отрегулируйте угол q и TIRF по мере необходимости до тех пор, пока не будут различимы отдельные зеленые шаровые молекулы. Отрегулируйте интенсивность лазера и время экспозиции, чтобы визуализировать флуоресцентные молекулы без их слишком быстрого фотоотбела.
Затем отрегулируйте контраст, чтобы лучше визуализировать молекулы. Ровно через пять минут после начала бесплатной инъекции биотина и остановки потока из шприца насоса, чтобы наблюдать изменения в молекулярной конформации с использованием потока ставки между 5000 и 30000 микролитров в час. С VWF очень важно применять по крайней мере небольшое количество потока, например, 30 секунд 10 000 микролитров в час потока ровно через пять минут после бесплатной инъекции биотина.
Повторите это во всех различных областях микрофлюидного устройства и найти молекулы, которые могут расширить и расслабиться на несколько циклов запуска и остановки потока. Обратите внимание, сколько времени требуется молекулам, чтобы достичь максимального расширения и полного расслабления и записывать видео непрерывного поведения молекул под потоком стрижки. Гибкость молекулы для изменения подтверждения часто демонстрируется его способностью удлиняться по мере того, как более высокие скорости снора применяются из-за увеличения потока.
Расширение по сравнению с кривой скорости снопы молекулы фактора фон Виллебранда полезно для характеристики биомеханических свойств белка. Флуоресценция микроскопии изображения ДНК lambda аналогичным образом показывают увеличение расширения на более высокие скорости стрижки на 30 секунд и постепенное расслабление в течение двух минут после того, как поток остановлен. При работе с VWF, не забудьте инкубировать его только в течение трех минут и бесплатный биотин в течение пяти минут до начала потока.
Это имеет решающее значение для формирования оптимального числа или биотин-стрептавидин связей, необходимых для обратимого распутывания. Этот метод может быть адаптирован для визуализации взаимодействия в режиме реального времени между несколькими биомолекулами и характеристики их функций. Например, можно было бы лучше понять образование свечи тромбоцитов, визуализируя VWF распутывание под высоким снофом и его связывание с молекулой адгезии тромбоцитов GPIb-альфа с помощью этого метода.
