Это демонстрация простого метода выражения, экстракции и очистки рекомбинантных человеческих IgG, слитых с GFP в связанных с табаком растениях Nicotiana benthamiana. Этот протокол может быть использован для очистки и визуализации растительных антител, синтеза антител и большинства белков, которые могут быть очищены с помощью колонки хроматографии. Этот протокол позволяет исследователям и студентам университетских рабочих лабораторий визуализировать GFP помеченные белки на большинстве этапов процесса производства белка.
Поместите гранулы торфяного грунта на поднос и залить предварительно кипяченой, еще горячей водой над торфяными гранулами для полного расширения. Пеллеты займет несколько минут, чтобы полностью расширить. После того, как поддоны будут полностью расширены, поместите два-три семена Nicotiana benthamiana на каждую торфяную гранулу с помощью пинцета.
После этого вам нужно будет залить около 0,5 дюйма воды, чтобы покрыть дно лотка. Не забудьте обозначить лоток датой посева. Продолжайте поливать саженцы ежедневно соответствующим количеством удобрений.
Лоток должен быть покрыт влажным верхом и поместить в камеру роста. Семенные торфяные гранулы должны храниться в камере роста при 23-25 градусах Цельсия с 16-часовым фото периодом и 60%-ной относительной влажностью. Через неделю удалите дополнительное растение из гранул, оставив каждый торфяной поддон только с одним саженцем.
Когда растениям будет две-три недели, перенесите каждую торфяную гранулу в отдельный горшок, содержащий контролируемую влагой почву. Продолжайте поливать саженцы ежедневно одним граммом на литр удобрения, никогда не оставляйте почву полностью сухой. Растения готовы к проникновению, когда им пять-шесть недель.
Следующие шаги должны быть сделаны рядом с горелкой Bunsen и основные асептические методы должны быть применены, чтобы избежать загрязнения. Вам понадобится пластина Lb kanamycin. Один микрограмм на миллилитр концентрации канамицина.
строгий с двумя мутациями EHA105 укрывательство желаемого kanamycin устойчивый построить и вырос в одночасье. EHA105 является одним из наиболее часто используемых штаммов Agrobacterium две мутации. Для начала культуры, заполнить коническую трубку с 10 миллилитров фунта средств массовой информации, далее, на 10 микролитров 100 микрограмм на миллилитр канамицин, вы также можете добавить 10 микролитров 2,5 микрограмма на миллилитр рифампицина для предотвращения загрязнения электронной палочки.
С тарелки вы будете использовать одну изолированную колонию, проверенную PCR, чтобы развивать свою новую культуру. Выберите изолированную колонию и привить его в фунт. Поместите прививку на шейкер.
инкубировать при 30 градусах по Цельсию и от 120 до 150 об /мин за ночь. На следующий день, если культура Агробактерий обращается к OD600 равна 0,6 до 0,9 он может быть использован для проникновения. Если он зарос OD600 выше одного-двух миллилитров должны быть переведены на свежий фунт с антибиотиками и выросли до необходимых OD600.
После того, как в соответствующих OD600 место культур в центрифуге, убедившись, что центрифуга сбалансирована. Забросать бактерии центрифугой при температуре 4 500 г в течение 20 минут при комнатной температуре. Они не могут выть из обоих образцов.
Затем повторно пойдите каждую гранулу и один буфер проникновения X, чтобы довести окончательный OD до 0,4. Объедините равные объемы каждой конструкции синтеза IgG с конструкцией световой цепи, чтобы получить окончательный OD 0,2 на конструкцию в каждой трубе. Возьмите скрепку и пять-шесть недель и бентамиана завода от шага один.
Используя острый край скрепки развернулся сделать небольшой прокол в первом эпидермального слоя листа. Избегайте проколов листа на всем пути до конца. Заполните один миллилитровый шприц без иглы, прикрепленной к подготовленному раствору Agrobacterium, со второй шага.
Обложка отверстие, сделанное в предыдущем шаге с конца шприца. И медленно нажмите, чтобы ввести бактерии в лист при применении мягкого встречного давления из-за листа. Попробуйте проникнуть большую часть листа и тыкать лист максимум три-четыре раза, избыток листьев ущерб может помешать выходу белка.
Смотреть лист темнее, как раствор вводится без применения слишком большого давления на шприц. Проникший растительный лист будет казаться в основном темным снизу. Обратите внимание, что этот бактериальный раствор должен быть достаточно, по крайней мере три-четыре растения на конструкцию.
Автоклав любого оставшегося бактериального раствора перед отбрасывание. После завершения иглы менее инфильтрации, место растений обратно в камеру роста и продолжать поливать ежедневно. Наблюдал листья при хлорозе, некрозе, а также при флуоресценции GFP, зимней длинной и коротковолной УЛЬТРА лампе.
Обычно листья на четыре и пять дней показывают самый высокий GFP флуоресценции. Урожай все листья на четыре-пять дней после инфильтрации и весят общее количество листового материала. Вы можете использовать материал листа немедленно для обработки вниз по течению, или вы можете заморозить его в отрицательных 80 градусов по Цельсию, пока он не готов использовать Место проникли растения обратно в камеру роста и продолжать поливать ежедневно.
наблюдается листья для хлороза, некроза, изменения цвета и листьев ткани смерти в проникли областях. Наблюдаемые растения для флуоресценции GFP. Если GFP присутствует под длинной и коротковолной УФ-лампой.
Выражение белка увеличивается с течением времени, при этом самая высокая флуоресценция обоих конструкций GFP обычно происходит между днями четыре и пять. Урожай всех листьев на четыре-пять дней после инфильтрации и весят общий материал листьев. Используйте его немедленно для процессов вниз по течению или заморозить при отрицательном 80 градусов по Цельсию до готовности к использованию.
Во время процесса смешивания, убедитесь, что сохранить буферы и блендер чашки на льду или при четырех градусах по Цельсию перед использованием. Поместите растительную ткань с 4-го шага в чашку досудебного блендера. При охлажденном буфере экстракции, содержащем соответствующие концентрации PMSF и натрия аскорбата в чашку блендера.
Поместите чашку блендера на блендер, возьмите предварительно вырезать лист пара пленки и растянуть его поверх чашки блендера. Смешайте ткани листьев с буфером экстракции, чтобы представить себе 80 с 22-м интервалом. Вам придется хорошо перемешать между циклами смешивания по мере необходимости.
Смесь должна выглядеть однородной без кусков листового материала. Перенесите смешанный материал в стакан. На бар перемешать и перемешать его в течение четырех градусов по Цельсию в течение 30 минут для повышения белка solubility и дать осадки твердых веществ.
Поместите два слоя голой ткани на чистый стакан на лед и залить экстракт через него, чтобы удалить большой лист мусора. После того, как все экстракт налил через зеркало ткань сложить зеркальную ткань, чтобы сжать остаточный экстракт листьев. Экстракт должен выглядеть темно-зеленым без видимых частиц.
Перенесите экстракт в центрифуговые трубки. Центрифуга экстракта при 16 000 Г в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Это будет гранулы любой оставшийся нерастворимый материал.
Убедитесь, что обе трубы сбалансированы и крышка ротора надежно затянута. После центрифугации гранулы должны быть видны, скажем, супернатантные и отбрасывать гранулы. Фильтр супернатант с помощью 50 миллилитров шприца и фильтра стекловолокна.
Соберите 50 микролитров образца и этикетки сырой экстракт для более длительного анализа. Настройка полипропиленовой колонки, которая содержит 20 миллилитров образца. Оцените количество суспензии, необходимой в зависимости от целевого типа иммуноглобулина и его сродства к смоле.
В этой демонстрации мы используем три миллилитров суспензии. Как правило, три миллилитров общей суспензии с объемом кровати 1,5 миллилитров эффективен для очистки нескольких миллиграммов антител. Тщательно пипетка необходимое количество повторного навоза в ограниченную колонку.
Откройте розетку столбца из нижней части столбца и позвольте ей стечь до тех пор, пока большая часть буфера не исчезнет. Немедленно залить 10 миллилитров мыть буфера один раз PBS на вершине. Пусть это стечь и повторить этот шаг мыть два раза.
Нанесите отфильтрованный образец из пятого шага в столбец и соберите поток через. Aliquot 50 микролитров потока через для более позднего анализа. Сохранить остальную часть потока через в случае, если антитела не связываются в смолу.
Вымойте смолу дважды с 10 миллилитров один раз PBS, чтобы уменьшить неспецифические связывания. При желании, aliquot 50 микролитров мытья, как буфер стекает через столбец, чтобы убедиться, что целевой антитела не ссылаются с буфером мытья. В то время как буфер мытья проходит через смолу, установка и этикетка пять микро центрифуг трубки с 125 микролитров стерильных, один моляр tris-HCL на рН восемь для нейтрализации elution буфера.
Кроме того, добавьте 30 микролитров из двух толярных трис базы, чтобы получить более концентрированный элуат. Во время элюции, УФ-излучение может быть использовано для визуализации. Это не нужно делать в течение всего периода элюции.
Если вы UV используется, не забудьте носить соответствующее личное защитное оборудование, чтобы избежать повреждения глаз и кожи. УФ-излучение не нужно использовать во время шага элюции. Уберите антитела, применив пять миллилитров буфера элюции к столбецу и соберите по одной миллилитровой фракции, к каждой назначенной трубке с предыдущего шага.
Немедленно регенерировать столбец, применяя 20 миллилитров, а затем 10 миллилитров буфера мытья. Убедитесь, что смола не остается в кислой среде в течение длительного периода времени. Elution должен появиться флуоресцентный.
Часто самая высокая флуоресценция наблюдается во втором элюции, но может варьироваться от добычи до экстракции. Для хранения вымойте смолу 10 миллилитров 20%этанола и PBS и дайте процедить на полпути. Повторите верхнюю часть, затем нижнюю часть колонны и держите в вертикальном положении при четырех градусах C.Определите концентрацию антител с помощью фотоспектрометра, измеряя абсорбцию на 280 нанометров.
Храните элуаты в отрицательных 80 градусов по Цельсию и aliquot 50 микролитров каждой фракции в отдельную трубку для дальнейшего анализа. Как правило, продолжительность белка может быть повторно использована до 10 раз без значительной потери эффективности. Обратитесь к руководящим принципам производителя для конкретных деталей определить концентрацию антител, используя спектрофотометр путем измерения поглощения на 280 нанометров.
Храните элуаты в минус 80 градусов по Цельсию и aliquot 50 микролитров каждой фракции в отдельную трубку для дальнейшего анализа. Анализ очищенного белка по странице можно сделать, следуя стандартным протоколам. Наблюдаемая флуоресценция в результате указывает на успех клонирования, инфильтрации и выражения конструкции, содержащей GFP.
В течение нескольких дней флуоресцентные лампы должны постепенно увеличиваться с высокой флуоресценцией в дни четыре и пять. При использовании белка G флуоресцентная белковая привязка и последующее элюция из колонки указывает на очищение синтеза IgG, содержащегося в качестве стабильного GFP. И УФ подвергается гель, вы можете увидеть только 25KDa и 75KDa полосы лестницы.
Вы также можете увидеть, не уменьшенный образец elution 2. Не уменьшенная элюция сохраняет свою флуоресценцию, так как относительный размер можно было бы ожидать от нетронутого IgG как его стабильного синтеза GFP. В coomassie пятно гель как уменьшенные, так и не уменьшенные образцы визуализированы.
Все компоненты лестницы видны, местные белки и IgG синтезы можно увидеть в общей экстракт супернатант и течь через образцы. Мытье содержит небольшое количество igG слияния. Elution один и четыре содержали менее концентрированный белок, как и ожидалось, так как большинство белков, как правило, ускользали от второго и третьего этапов элюции.
Elution 2, не уменьшая также можно увидеть несколько полос существуют во всех сокращения elution образцов. 75KDa указывает на тяжелый цепной предохранитель для GFP. 50KDa указывает только на тяжелую цепь, 25KDa указывает только на световую цепь, и 10 KDA, вероятно, указывает на деградацию, которая может быть предотвращена добавлением ингибиторов протеазы.
Этот протокол может быть использован для очистки любого антитела, слитого с любым желаемым целевым белком. Процесс может быть отредактирован для размещения различных количеств листового материала, а также позволяет визуально определить присутствие белка до, во время и после завершения процессов извлечения и очистки белка. Эти методы могут быть полезны в качестве элементов управления и могут быть целью для обучения методам.
