Этот протокол может быть использован для ответа на вопрос о том, влияет ли гидравлический разрыв пласта на бактерии в близлежащих потоках и, следовательно, на сами потоки и, следовательно, на сами потоки. Основным преимуществом этого метода является его целостный характер, поскольку он берет исследователя от сбора образцов до анализа данных. Продемонстрировать процедуру будут Джереми Чанси, биоинформатик в моей лаборатории, Сидни Регал, студент бакалавриата в колледже Джуниата, и Джиллиан Лейстер, менеджер моей лаборатории.
Чтобы собрать образцы отложений для экстракции нуклеиновых кислот, используйте перчатки, чтобы погрузить закрытую, стерильную коническую трубку размером 50 миллилитров в струйную воду с берега. Пока трубка погружена, снимите крышку и используйте крышку, чтобы зачерпнуть примерно три миллилитра осадка с глубины от одного до трех сантиметров в трубку. После сбора образца высыпьте все, кроме примерно одного миллилитра воды из пробирки, и используйте пипетку 1000 микролитров, чтобы добавить три миллилитра консерванта ДНК / РНК в образец.
Покрутите колпашку конической трубки в течение пяти секунд, чтобы тщательно перемешать консервант и образец и сохранить образец на льду. По возвращении в лабораторию храните образец при минус 20 градусах Цельсия для анализа ДНК 16S или минус 70 градусов Цельсия для анализа РНК метатранскриптомики. Для сбора фильтра полностью заполните и опорожните целую стерильную литровую бутылку струйной водой три раза, чтобы кондиционировать бутылку перед заполнением бутылки в последний раз.
На стабильной поверхности втяните полный объем струйной воды в стерильный шприц luer lock и подключите шприц к стерильному и свободному от ДНК/ РНК полиэфирсульфоновой фильтре диаметром 1,7 сантиметра с размером пор 0,22 микрона. Промывайте весь объем струйной воды через фильтр. Когда весь объем образца будет отфильтрован таким же образом, втяните примерно 20 миллилитров воздуха в шприц и протолкните воздух через фильтр, чтобы удалить лишнюю воду из фильтра.
Затем используйте микропипетку P1000, чтобы добавить два миллилитра консерванта ДНК / РНК в большее отверстие фильтра, удерживая фильтр горизонтально кончиком пипетки в бочке фильтра, чтобы гарантировать, что консервант попадает в фильтр. Затем запечатайте фильтр плотно обернутыми квадратами парафиновой пленки вокруг каждого отверстия и поместите фильтр в стерильный пакет для образцов на льду. Вернувшись из выборки, сохраните фильтры для 16S или для метатранскриптомного анализа, как показано на демонстрации.
Перед началом переноса образца очистите рабочую зону 10% отбеливателем и 70% этанолом. Для извлечения нуклеиновых кислот из образца осадка используйте стерилизованный металлический инструмент для пламени и этанола для переноса примерно 250 миллиграммов образца в микроцентрифужную трубку. Для экстракции нуклеиновых кислот из образца фильтра используйте 70% этанол и пламенную стерилизованную тиски, чтобы разорвать корпус фильтра на стерильной поверхности и удалить сердцевину из корпуса.
Используйте стерильный скальпель, чтобы разрезать сверху, снизу и вдоль шва сердцевины и использовать стерильный пинцет, чтобы сложить фильтровальную бумагу, прежде чем разрезать ее на небольшие кусочки скальпелем. Затем аккуратно поместите части фильтра в микроцентрифужную трубку, не контактируя с нестерилизованными поверхностями. Для лизиса клеток в любом типе образца подвергаем трубку разрушителем клеток на высокой скорости.
По крайней мере, через пять минут центрифугируют образцы и переносят супернатант в новую стерильную микроцентрифужную трубку. Добавьте буфер лизиса к супернатанту в соотношении один к одному и перенесите раствор на предоставленный фильтр. Поместите фильтр в новую микроцентрифужную трубку и добавьте в трубку 400 микролитров подготовительного буфера.
После центрифугирования добавьте в трубку 700 микролитров промывного буфера и снова центрифугировать фильтр. После отбрасывания проточной трубы добавьте в трубку 400 микролитров промывочного буфера для дополнительного центрифугирования и перенесите фильтр в новую стерильную микроцентрифужную трубку. Чтобы элюировать ДНК, обработайте фильтр 50 микролитрами воды без ДНКазы/РНКазы в течение пяти минут при комнатной температуре.
Тем временем поместите три фильтра HRC в коллекторную трубку и добавьте 600 микролитров раствора для подготовки HRC. После центрифугирования перенесите фильтр в новую стерильную микроцентрифужную трубку и перенесите элюированную ДНК в фильтр для центрифугирования. Протока содержит извлеченную ДНК.
Чтобы создать библиотеку РНК ДНК 16S, сначала используйте свежеизвлеканный продукт ДНК для амплификации рибосомальной РНК 16S со стандартным протоколом ПЦР. Смешайте семь микролитров полученного продукта ПЦР и 13 микролитров воды без ДНКазы и загрузите раствор ПЦР на 2%-агарозный гель. Затем запустите гель при 90 вольтах в течение 60-90 минут, чтобы проверить размер полосы в 386 пар оснований в качестве доказательства успешного усиления.
Чтобы очистить библиотеку рибосомной РНК ДНК 16S, объедините 10 микролитров продуктов ПЦР, которые дали яркие полосы и 13 микролитров образцов, которые дали слабые полосы в стерильной микроцентрифужной трубке и загрузили около 150-200 нанограммов каждого объединенного образца в отдельные лунки нового 2% геля. После запуска геля, как показано, высеките 386 полос пары оснований из геля и используйте коммерческий набор для очистки ДНК. Затем элюирует очищенную ДНК 30 микролитрами 10 миллимоляров гидрохлорида триса и упаковывает очищенные библиотеки в сухой лед перед отправкой для секвенирования следующего поколения.
В этом репрезентативном анализе все извлечения, кроме одного, будут названы успешными. Яркие полосы, наблюдаемые после амплификации ПЦР, указывают на успех протокола 16S. Образцы 16S должны иметь минимум 1000 последовательностей, причем по меньшей мере 5 000 должны быть идеальными, в то время как метатранскриптомные образцы должны иметь минимум 500 000 последовательностей, причем не менее 2 миллионов из них являются идеальными.
Показаны образцы отложений с 21 различных участков в 13 различных потоках для анализа 16S и метатранскриптомики. Из этих 21 участка 12 находились ниже по течению от деятельности по гидроразрыву пласта и классифицировались как положительные по гидроразрыву пласта, а девять находились либо выше по течению от деятельности по гидроразрыву пласта, либо в водоразделе, в котором фрекинг отсутствовал и классифицировался как отрицательный гидроразрыв пласта. По оценкам анализа ПЕРМАНОВА, наблюдаемое разделение между положительными и отрицательными данными ГРП свидетельствует о том, что на положительные пробы ГРП повлиял гидроразрыв пласта.
Наиболее важные случайные лесные предикторы выявят, какие признаки наиболее важны для правильной дифференциации выборок. Если таксон идентифицирован как важный с помощью модели случайного леса, его профиль устойчивости к противомикробным препаратам в положительных пробах гидравлического разрыва пласта можно сравнить с его профилем в отрицательных пробах гидравлического разрыва пласта. Если они сильно различаются, это может свидетельствовать о том, что в поток попала жидкость для фрекинга, содержащая биоциды.
Микробы повсюду, поэтому загрязнение является значительной потенциальной проблемой при этом типе работы. Начальные этапы переноса образца особенно подвержены этому. Если кто-то интересуется микробной биодеградацией или другим метаболизмом, секвенирование РНК из дробовика может быть использовано для исследования активной экспрессии микробных генов.
Этот метод позволяет стандартизировать молекулярные методы исследования бактериальных сообществ in-situ, а также биоинформатический анализ данных бактериальных последовательностей.
