Митохондрии являются важными органеллами эукариотических клеток, способных к аэробной дыхания. Их дисфункция является хорошо известным источником человеческих заболеваний. Дрожжевые митохондрии Бейкера содержат круговой геном, кодирующий восемь белков.
В этом видео мы описали протокол, используемый для анализа биосинтеза белка в дрожжевых митохондриях с помощью радиоактивной маркировки переводческих продуктов и последующего разделения гель-электрофорезом. Процедура включает в себя несколько основных шагов. Полоса дрожжей из замороженных фондовых культур на свежих тарелках с соответствующей среде.
Положите тарелки в инкубатор культуры при 30 градусах в течение 24 до 48 часов. Привить эти культуры в двух миллилитров среды из свежей полосы в 15 миллилитров трубки и инкубировать их ночь агитации при 200 об /мин при 30 градусах. Измерьте оптическую плотность культуры на длине волны 600 нанометров.
Возьмите объем, соответствующий 0,2 абсорбции единиц в стерильных трубках Палитра дрожжевых клеток на 9000 G в течение 30 секунд при комнатной температуре. Откажитесь от этого супернатанта. Вымойте клетки с 0,5 миллилитров стерильной воды вихрем в течение пяти секунд.
Паллетт дрожжевых клеток при температуре 9000 Г в течение 30 секунд при комнатной температуре. Откажитесь от супернатанта. Разбавить клетки в двух миллилитров свежей протрите агар среды.
Инкубационный край, принятый при 200 об/мин и 30 градусах, пока оптическая плотность не достигнет от 1,5 до 1,9 от 1,5 до 1,9 значения. Передача объема культуры, эквивалентного одному оптическому блоку в микро центрифуге трубки. Спин трубки при 3000 G в течение одной минуты.
Откажитесь от супернатанта. Вымойте клетки с 0,5 миллилитров стерильной воды вихрем в течение пяти секунд. Паллетт дрожжевых клеток на 9000 Г в течение 30 секунд при комнатной температуре отбросить супернатант.
Повторно приостанавливать дрожжевые клетки в 0,5 миллилитров стерильного буфера перевода. Поместите подвеску в 15 миллилитровую трубку. Добавьте циклохексимид к клеточной суспензии до конечной концентрации 0,2 миллиграмма на миллилитр инкубации в течение пяти минут края, принятых при 200 об/мин и 30 градусов для ингибирования цитозолического перевода.
Добавить от 25 до 30 Добавить от 25 до 30 микрокурит S35 methionine S35 метамфетамина в клеточной подвески и инкубировать в течение 30 минут края при 200 об /мин и 30 градусов. Добавить неоцеливый холодный метионин и боримицин, чтобы остановить маркировку инкубации в течение 10 минут края при 200 об/мин и 30 градусов. Соберите дрожжевые клетки путем центрифугации при 9000 Г в течение 30 секунд.
Вымойте клетки с 0,5 миллилитров стерильной воды вихрем в течение пяти секунд. Паллетт дрожжевых клеток при температуре 9000 Г в течение 30 секунд при комнатной температуре. Откажитесь от супернатанта.
Добавьте 75 микролитров буфера лиза в палитру и вихрь в течение пяти-десяти секунд. Добавьте 500 микролитров буфера 0,5 молярных трисов буфера 0,5 моларных три с рН 6,8. С рН 6,8.
Вортекс кратко. Добавьте в образец 600 микролитров метанола. Вихрь в течение пяти секунд.
Добавьте в образец 150 микролитров хлороформа. Вихрь в течение пяти секунд. Центрифуга образцов в течение двух минут в 12 000 Г. Осторожно отбросьте опафас с помощью пробоя.
Добавьте в образец 600 микролитров метанола. Тщательно перемешайте трубку несколько раз. Образцы центрифуг в течение двух минут при 12 000 Г.Отброс супернатантов.
Воздух высушит паллету в течение двух минут при 80 градусах. Растворите осажденные белки в 60 микролитров буфера образца Laemmli. Нагрейте образцы в течение 10 минут при температуре 14 градусов.
Причина 17,5%Laemmli SDS полиакриламид гель. Загрузите 15 микролитров каждого образца в карманы. Запустите гель в холодной комнате, пока синий краситель достигает примерно 65% гель лимфы.
Пятно гель с Kumasi блестящий синий и сделать сканирование или фото, которое требуется в качестве управления загрузкой. Высушите гель в фене. Храните его в кассете с экраном фосфора хранения в течение трех-пяти дней.
Сканирование экрана на фосфоре изображения. Следуя описанной выше протоколу, мы назначили продукты митохондриального перевода из двух штаммов Saccharomyces cerevisiae. Дикий тип и мутант вариант удаления гена Aim23 кодирования митохондриального перевода инициации фактор три.
Продукты митохондриального перевода уже активно маркированы и разделены в денатурированном полиакриламинидированном геле. Образцы были собраны каждые две с половиной минуты до насыщения, чтобы построить курс времени. Гель был окрашен, высушен и показан после пятидневной экспозиции.
В случае успешного эксперимента на рисунке демонстрируется восемь полос, назначенных в соответствии со стандартным шаблоном. Тем не менее, интенсивности отдельных полос может быть весьма переменной в зависимости от напряжения и экспериментальных условий. Каждая группа соответствует одному переводу продукта.
Данные свидетельствуют о том, что штамм мутантов способен синтезировать митохондриальный белок, потому что все продукты, появляющиеся в диком типе, видны в этом мутанте. Тем не менее, интенсивности полос отличаются от дикого типа, а это означает, что это удаление Aim23 влияет на экспрессию митохондриального гена. Кумаси варится в синем пятно и служит в качестве контроля погрузки.
Их результат в данных может быть количественно определить различия между штаммами или экспериментальных условий с помощью изображения G или изображения Куан программного обеспечения. Для них рассчитывается отношение сигнала, соответствующего каждому продукту, к общему сигналу. Средние значения и стандартные отклонения рассчитываются по крайней мере в трех независимых экспериментах.
Кинетики синтезированного белка перевернулся изучается в эксперименте в прошлом году. Образцы собираются в указанных точках времени после того, как реакция маркировки останавливается холодным метионином и боримицином. Этот контроль необходим для оценки стабильности продукта.
Иммуно-окрашивание с Антителами Anti-Porin одно будет управлением нагрузки. Мы описали метод, который часто используется для изучения биосинтеза белка в дрожжевых митохондриях. Этот протокол относительно прост и быстр в работе.
В то же время, это позволяет получить ценную информацию о скорости перевода четырех дрожжей митохондриальных мРНК, что весьма выгодно. Тем не менее, он имеет ряд ограничений, требующих дополнительных экспериментов и лежит в этом межгосударственном уровне белков и мРНК. Он может предоставить информацию об этих функциях в митохондриальной системе перевода, но для обнаружения механизма следует использовать более продвинутые методы.
