Этот протокол прост в выполнении. Фаза клонирования позволяет получить большее количество Т-клонов из свежих образцов. Кроме того, фенотип и функция Т-клеток могут быть легко проанализированы.
Продемонстрировать процедуру будет Мэри Кристофер, докторант из моей лаборатории. Чтобы вызвать клонирование Т-клеток, используйте шип мешка с клапаном без иглы, чтобы открыть облученный пухлый мешок для пальто в ламинарной вытяжке. Переложите до 50 миллилитров крови из мешка в колбу Т-150 и добавьте в колбу 70 миллилитров PBS.
Осторожно наложите 30 миллилитров разбавленной крови на 20 миллилитров градиента плотности в каждой из четырех конических трубок по 50 миллилитров и разделите клетки центрифугированием градиента плотности. Осторожно аспирируйте супернатант и перенесите PBMC из каждой трубки в одну новую 50-миллилитровую трубку. Используйте PBS, чтобы довести конечный объем до 50 миллилитров и собрать PBMC путем центрифугирования.
После второй промывки в тех же условиях суспендируют изолированные питательные клетки в 10 миллилитрах клеточной культуральной среды для подсчета и добавляют 25 миллилитров 70-миллилитров клеточной культуральной среды, дополненной 50 единицами раствора IL-2, в каждую из двух пробирок по 50 миллилитров. Затем добавляют питательные клетки в одну трубку при 2 на 10 до 6-й клетки на миллилитр клеточной культуральной среды, дополненной концентрацией IL-2. Чтобы создать культуру Т-лимфоцитов, объедините клон Т-клеток, содержащий супернатанты из колбы образца стенотического клапана, в одну 50-миллилитровую трубку и соберите клетки путем центрифугирования.
Промыть гранулу три раза в 50 миллилитрах PBS за промывку, прежде чем повторно использовать клетки в 1 миллилитре клеточной культуральной среды для подсчета. Разбавляют клетки до концентрации от 1 на 10 до 3-й клетки на миллилитр и добавляют 500 микролитров клеток в трубку клеточной культуральной среды, дополненной IL-2 без питающих клеток. Добавьте суспензию фидерной ячейки в пластиковую чашку Петри размером 100 на 15 миллилитров и добавьте 100 микролитров фидерных ячеек в каждую лунку из соответствующего количества U-образных 96-луночных пластин для эксперимента.
Затем добавьте Т-клетки в чашку Петри и добавьте 100 микролитров Т-клеток к каждой фидерной клетке, хорошо дополненной в течение одной недели инкубации в инкубаторе клеточной культуры. Изоляция PBMC имеет жизненно важное значение для получения питающих клеток и позволяет обнаруживать и характеризовать инфильтрирующие лейкоциты в образцах аортального клапана. После двух недель инкубации можно получить клон Т-клеточной популяции.
Здесь показана схема анализа субпопуляций Т-клеток у пациентов с заболеванием кальцифицированного аортального клапана. Как наблюдалось у этого пациента, было больше CD4 + Т-клеток, чем CD8 + Т-клеток. Проточный цитометрический анализ неклонированных Т-клеток подтверждает, что одни и те же маркеры Т-клеток присутствуют как в образцах нативных клапанов, так и в образцах клонов.
Взятые вместе, эти данные указывают на то, что Т-клетки присутствуют в кальцинированных аортальных клапанах с CD45 + лейкоцитами, предполагая, что заболевание кальцифицированного аортального клапана связано с активацией иммунной системы и воспалительной активностью. Этот метод очень универсален. Он может быть применен к различным протоколам, для которых исследователь должен быть в состоянии изолировать клетки из ткани, для функциональной характеристики.
Имейте в виду, что важно работать в стерильных условиях, чтобы избежать загрязнения, и критически наблюдать за клетками под микроскопом.
