Здесь мы представляем улучшенные протоколы для подготовки крио-ЭМ образцов с опорными пленками с использованием нового флотационного блока, который облегчает обработку таких деликатных пленок. Ключевым преимуществом этого метода является то, что образец защищен от воздушной водной границы, где могут возникать повреждающие эффекты, такие как денатурация. Один из протоколов, представленных здесь, позволяет избежать любого дорогостоящего лечения для превращения графирования в гидрофильный, тем самым повышая его доступность для всего сообщества ЭМ.
Небольшие флотационные устройства еще не получили широкого применения электромикроскопией для хорошей подготовки. Таким образом, эти визуальные демонстрации могут обеспечить ориентир для их использования. Для начала промыть решетки ТЭМ двойной дистиллированной водой и этель-ацетатом с последующей плазменной очисткой.
Затем добавляют от 10 до 12 микролитров образца в буферный обменный колодец, флотационный блок и 10-12 микролитров 2%-ного раствора ацетата писсуара в соседний небуферный обменный колодец для отрицательного окрашивания. Важно соблюдать соответствующие меры предосторожности при работе с пятном. Аккуратно нарежьте два небольших кусочка слюды с предварительно нанесенной углеродной пленкой сверху.
Убедитесь, что фрагменты слюды достаточно широкие, чтобы поместиться в колодец, и длиннее длины скважины, так что фрагмент может сидеть на колодце, пока углерод плавает, и есть достаточно места для обработки фрагмента пинцетом. Погружайте слюду в скважину с приблизительным углом 45 градусов до тех пор, пока слюда не сядет на рампу скважины и углеродный слой не будет наблюдаться на поверхности жидкого образца. После инкубации углерода с образцом очень медленно извлекайте слюдяной лист, чтобы восстановить углеродную пленку и свести к минимуму остаточное удержание образца вискому покровом.
Тщательно промокайте слюду, постукивая по нижней неуглеродистой поверхности фильтровальной бумагой, чтобы удалить лишнюю жидкость и погрузить фрагмент слюды в противоположный колодец, содержащий 2%-ный раствор ацетата писсуара, чтобы заменить углеродный слой с отрицательным пятном. Восстановите плавающий углеродный слой с помощью покрытой святым углеродом стороны промытой и очищенной плазмой эм-сетки. Затем оставьте решетки сушиться на воздухе до получения изображения на ТЭМ, предпочтительно покрывая их, чтобы избежать загрязнения воздуха.
После очистки сеток ТЭМ, как было продемонстрировано ранее, подготовьте суспензию оксида графена непосредственно перед использованием и тщательно вихрьте. Затем добавьте от 10 до 12 микролитров суспензии оксида графена в четыре небуферные обменные скважины. вдоль флотационного блока.
Добавьте от 10 до 12 микролитров двойной дистиллированной воды или сверхчистой воды в оставшиеся четыре буферные обменные скважины блока. Осторожно нанесите четыре сетки на суспензию оксида графена в каждой скважине и инкубируйте в течение одной минуты, чтобы убедиться, что сторона, покрытая священным углеродом, находится в контакте с раствором. Через одну минуту тщательно восстановите каждую сетку, сдвинув пинцет в канавку пинцета каждого небуферного обменного колодца.
Осторожно и ненадолго подтолкните медную неуглеродистую сторону каждой сетки двойной дистиллированной водой в соседнем колодце, пока капля воды не будет видна на сетке. Затем аккуратно подержите каплю воды вверх ногами о лист фильтровальной бумаги. Накройте сетки и оставьте их в пинцете для высыхания на воздухе.
Поместите четыре моющие сетки поверх медного графического листа, нанесенного на стеклянный слайд, и покройте каждую сетку каплей изопропанола, чтобы обеспечить тесный контакт между монослойным графеном и сеткой. После полного испарения изопропанола поместите медный графеновый лист с сетками на раствор хлорида железа в стеклянную чашку Петри. Затем накройте блюдо, чтобы избежать загрязнения воздуха, и оставьте его травиться при комнатной температуре на ночь.
Используйте петлю диаметром, превышающим размер сетки TEM, чтобы выловить сетки, плавающие на графеновом монослое, и аккуратно переложить их в стеклянную чашку Петри, содержащую двойную дистиллированную воду для мытья. Дважды вымойте сетки в воде и переложите сетки в чашку Петри, содержащую буфер для отбора проб, до тех пор, пока не будет подготовлен проб и погружена в замораживание. Добавьте от 10 до 12 микролитров образца в колодец флотационного блока.
Когда образец будет готов в блоке, выберите сетку с графеновым покрытием из буферного раствора с помощью пары чистых пинцетов и поместите ее на поверхность образца, содержащего хорошо. После соответствующего инкубационного периода подберите сетку парой чистых морозильных пинцетов и приступайте к промоктыванию и витрификации. Отрицательно окрашенные сетки, приготовленные с помощью опорного флотационного блока, обычно покрываются аморфным углеродом по всей поверхности сетки.
В то время как разрушение углеродной пленки происходит в некоторых случаях, большое количество квадратов сетки являются нетронутыми и, следовательно, применимы для целей отрицательного окрашивания. Аналогичным образом, хорошее покрытие пленки обычно достигается по всей сетке с использованием протокола оксида графена. Сетки из оксида графена могут быть быстро приготовлены из сырья и обеспечивают высокую защиту образца.
Сохранение графена влажным и применение образцов на месте непосредственно перед замораживанием достаточно для создания подходящих слоев льда для крио-ЭМ. Этот протокол не требует оборудования для превращения графена в гидрофильный и обеспечивает преимущество для извлечения образцов. Опорный флотационный блок имеет два игольчатых порта на месте каждой скважины, которые позволяют буферу расширяться в C2, что очень полезно для образцов, полученных из градиентов глицерина.
Флотационный блок позволил исследовать методы очистки сродства на сетке за счет использования управляемого буферного потока небольших объемов, а также функционализированных опорных пленок.
