Этот протокол позволяет успешно изолировать и культивировать первичные связанные с раком фибробласты из муринового рака молочной железы, для скрининга новых наночастиц, предназначенных для нацеливания на опухолевую микросреду. Первичные CAF представляют собой наиболее надежную и физиологическую модель для исследований опухолевой стромы in vitro. В этом протоколе мы описываем, как достичь оптимального урожая.
Для начала приготовьте смесь для пищеварения для диссоциации опухоли и замочите от трех до пяти миллиметровых фрагментов опухоли в растворе после плотного закрытия трубки. Переверните трубку вверх дном, проверив, что все кусочки опухоли находятся в нижней части трубки по направлению к колпачку. Затем прикрепите трубку к механическому диссоциатеру в соответствующем корпусе и запустите программу диссоциации, специально разработанную для тяжелых опухолей.
После пробега отсоеднейте трубку и поместите ее вверх дном, чтобы инкубировать образец при 37 градусах Цельсия в течение 40 минут с легким встряхиванием. Затем повторно прикрепите трубку к диссоциатеру в правильном корпусе и дважды запустите программу диссоциации для жестких опухолей, гарантируя, что в конце процедуры не останется больших кусочков ткани. Отфильтруйте образец через 40-микрон-клеточный сетчатый фильтр в 50-миллилитровой трубке.
Затем промыть фильтр 10 миллилитрами среды RPMI 1640 и центрифугой. После центрифугирования повторно суспендируют гранулу в буфере PBE, состоящем из PBS, 0,5% BSA и двух миллимоляров ЭДТА, и подсчитайте ячейки с Trypan Blue. Восстановите буфер связывания удаления мертвых клеток, разбавляя 20-кратный связывающий буферный раствор стерильной двойной дистиллированной водой.
Промыть ячейки пятью миллилитрами 1X связывающего буфера и центрифуги. После центрифугирования повторно суспендируют клеточную гранулу с 0,1 миллилитра микрошаров удаления мертвых клеток на срок до 10-седьмых клеток и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут. Во время инкубации подготовьте магнитную подставку под капотом и повесьте к ней ферромагнитные разделительные колонны, кончики которого направлены вниз.
Уравновешивайте колонны 0,5 миллилитрами буфера холодного связывания и дождитесь, пока раствор не протечет. После инкубации добавьте 400 микролитров буфера холодного связывания в шариковую и клеточную суспензию. Загрузите весь объем на колонну и соберите стоки в 15-миллилитровую трубку.
Промыть колонну четыре раза 0,5 миллилитрами буфера холодного связывания и собрать общий объем сточных вод в той же трубе. Для истощения фибробластов, не связанных с раком, отфильтруйте клеточную суспензию с помощью 70-микронный клеточный ситечко, смоченное PBS, и центрифугируют клетки. Удалите супернатант и повторно суспендирует гранулу в 80 микролитрах холодного буфера ПБЭ.
Добавьте 20 микролитров коктейля истощения фибробластов, не связанного с опухолью. Хорошо перемешайте и высиживайте образец при 4 градусах Цельсия в течение 15 минут в темноте. Во время инкубации с шариками подготовьте ферромагнитные обеднители колонны на магнитной подставке.
Уравновесьте колонны двумя миллилитрами холодного буфера PBE и подождите, пока раствор не пройдет. После инкубации добавьте 400 микролитров буфера в шариковую и клеточную суспензию. Загрузите весь объем на колонну и соберите стоки в 15-миллилитровую трубку.
Дважды промыть колонну двумя миллилитрами ПБЭ. Соберите общий объем сточных вод в ту же трубу и центрифугировать стоки. Для положительного отбора связанных с раком фибробластов повторно суспендируют гранулу в 80 микролитров холодного буфера ПБЭ.
Затем на 20 микролитров опухолеассированных фибробластов микрограбластов и инкубируют образцы при 4 градусах Цельсия в течение 15 минут в темноте. Во время инкубации подготовьте ферромагнитные разделительные колонны на магнитной подставке и уравновесьте их 0,5 миллилитрами холодного буфера ПБЭ. После инкубации добавьте 400 микролитров ПБЭ в шариковую и клеточную суспензию.
Загрузите весь объем на колонну и позвольте немаркированным ячейкам течь в 15-миллилитровую трубку. Промыть колонну три раза 0,5 миллилитрами буфера ПБЭ и собрать общий объем сточных вод в той же трубе. Снимите колонку с магнита и поместите ее в трубку размером 1,5 миллилита.
Добавьте один миллилитр ПБЭ на колонну и немедленно втолкните плунжер в колонну, чтобы промыть ячейки. После центрифугирования повторно суспендируют клеточную гранулу в соответствующем объеме DMEM и засейте клетки в тканевую культурную пластину. Проверьте плотность клеток под микроскопом и поместите пластину на 37 градусов по Цельсию и 5% углекислого газа, чтобы позволить клеткам прилипать и расти.
Инъекция клеток люциферазы 4T1 в жировую подушку молочной железы самок мышей привела к росту обнаруживаемой опухолевой массы через пять дней после имплантации. Чтобы найти окно жертвоприношения, адекватное для изоляции CAF, был достигнут оптимальный компромисс между более высоким размером опухоли и визуализацией биолюминесценции, с одной стороны, и возникающим изъязвлением и некрозом опухоли, с другой стороны. День 20 был установлен в качестве временной точки для оптимизации восстановления клеток после процесса изоляции.
Еще два прохода были необходимы для изоляции популяции ЦАФ из панели собранных жизнеспособных клеток, истощения неопухородных фибробластов и обогащения опухолеациоциоцироваженных фибробластов. Клетки CAF выявили большую морфологию верететенообразной формы, типичную для фибробластов, и отличались от опухолевых клеток 4T1. Выражение FAP, последовавшее за пятью отрывками, подтверждает, что первичная культура CAF сохранила свои первоначальные характеристики.
Когда продолжительность и температура инкубаций с микробусами не поддерживались, среди выделенной культуры были обнаружены клоны с различной морфологией. Эти загрязняющие клетки росли быстрее и преобладали над первичной культурой CAF. Связывание CAF с функционализированным нанопрепаратом Hfn-FAP ферритина человека увеличивалось при концентрации фрагментов антител один к одному и от одного до пяти в три раза по сравнению с голым HFN.
Напротив, для опухолевых клеток 4T1 голый HFN показал более высокое связывание, чем функционализированный HFN. Чтобы увеличить выход примеси изолированного CAF, держите буферы холодными, соблюдайте время инкубации с шариками и вытягивайте до четырех опухолей на столб перед заключительным этапом обогащения. Изолированные КАФ могут быть использованы для скрининга нескольких потенциальных нанопретратов с точки зрения связывания, поглощения и фармакологической эффективности, прежде чем приступать к доклиническим экспериментам in vivo.
Изоляция CAF позволила нам проверить, могут ли наночастицы быть использованы для нацеливания на микроокружение опухоли. Таким образом, прокладывая путь к новым таргетным методам лечения, работающим в синергии с химиотерапией.
