Успешная диссоциация небольших количеств нервной ткани может оснастить лаборатории для получения структурно-специфического понимания эффективности лечения, клеточной функции, а также заболеваний и механизмов лечения. Этот протокол нейронной диссоциации последовательно дает очень жизнеспособную и фактическую одноклеточную суспензию. Кроме того, мы можем обрабатывать образцы, которые составляют лишь часть тех, для которых предназначены коммерческие наборы.
Правильное планирование и подготовка являются ключом к успешному результату для этой техники. Было бы полезно провести несколько тренировочных раундов для ознакомления с протоколом. После обезболивания шестимесячной самки мыши C57BL/6J зажмите нижнюю часть живота и поднимите кожу с помощью щипцов.
Затем ножницами прорежьте мех и кожу до нижней части грудной клетки. Сделайте два диагональных разреза, начинающихся ниже грудной клетки и движущихся к каждому плечу. Затем тщательно резецируйте диафрагму и грудную клетку, чтобы обнажить сердце.
После тщательного удаления любой соединительной ткани вокруг сердца используйте ножницы, чтобы обрезать правое предсердие. Затем выключите поток изофлурана к дыхательному аппарату. Удерживая сердце устойчивым щипцами и скосом иглы бабочки лицом вверх, проткните левый желудочек, сохраняя иглу на одном уровне и параллельно животному.
Далее, удерживая иглу на месте, включите насос и перфьминируйте не менее 30 миллилитров физиологического раствора или гепарина до тех пор, пока жидкость, выходящая из сердца, не станет непрозрачной, а печень и легкие не бледнеют по цвету. После перфузии выключите насос, извлеките иглу и перенесите мышь в область рассечения. После обезглавливания отрежьте мех от затылка до глаз и очистите кожу обратно, чтобы обнажить череп.
Затем обрежьте череп между глазами и сделайте два разреза в задней части черепа в положении «10» и «2 часа». Затем сделайте один длинный разрез вдоль средней сагиттальной линии черепа до первоначального разреза между глазами. Далее, используя щипцы, отклейте две половинки черепа в стороны.
Затем используйте шпатель, чтобы удалить мозг и поместить его в 60-миллиметровую стеклянную чашку Петри, наполненную холодным DPBS и хранящуюся на льду. С помощью скальпеля или бритвы отделите каждое полушарие и удалите обонятельные луковицы и мозжечок. Затем удалите средний мозг до тех пор, пока гиппокамп не обнажится.
Далее закрепите мозг щипцами. Затем, используя второй набор щипцов, осторожно вытащите гиппокамп из каждого полушария. Переложите оба гиппокампа в меченую 1,5-миллилитровую трубку, содержащую холодный DPBS, и поместите трубку на лед.
С помощью щипцов переложите кусочки ткани гиппокампа в трубку С и добавьте в трубку 30 микролитров ферментной смеси 2. После скручивания колпачка и затягивания до щелчка поместите трубку в диссоциатор и запустите соответствующую программу. Пока программа работает, предварительно намочите 70-микронный клеточный сетчатый фильтр, размещенный на конической трубке объемом 50 миллилитров с двумя миллилитрами буфера BSA.
После завершения программы диссоциации добавьте четыре миллилитра буфера BSA в диссоциированную ткань и фильтруйте смесь через клеточный ситечко на конической трубке объемом 50 миллилитров. Затем добавьте 10 миллилитров DPBS в трубку C. Затем закройте трубку, осторожно закрутите раствор и процедите его через клеточный ситечко на конической трубке объемом 50 миллилитров.
Центрифугируйте отфильтрованную клеточную суспензию, выбросьте супернатант, не нарушая гранулу, и сохраните гранулу. Для удаления мусора повторно суспендируйте гранулу с 1 550 микролитрами холодного DPBS и перенесите суспензию в меченую коническую трубку размером 50 миллилитров. Затем добавьте 450 микролитров холодного раствора для удаления мусора и пипетку вверх и вниз.
Аккуратно наложите клеточную суспензию одним миллилитром холодного DPBS, удерживая наконечник к стенке конической трубки. Повторяйте процедуру до тех пор, пока общее наложение не составит два миллилитра. Далее центрифугируют суспензию в 3000 раз G в течение 10 минут с полным ускорением и полным перерывом.
Аспирируйте самый верхний слой, затем проведите кончик пипетки вперед и назад, чтобы аспирировать белый средний слой. Удалите как можно больше среднего слоя, не нарушая самый нижний слой. Затем добавьте два миллилитра холодного DPBS и пипетку вверх и вниз, чтобы перемешать.
Затем центрифугируют суспензию в 1000 раз G в течение 10 минут с полным ускорением и полным перерывом. После центрифугирования отбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитровом буфере BSA. После подсчета клеток центрифугируют оставшуюся клеточную суспензию и повторно суспендируют гранулу в 50 микролитрах разбавленного живого мертвого пятна.
Затем переложите образец в меченую проточную трубку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 8-10 минут в темноте. После инкубации добавьте 500 микролитров буфера BSA и повторите стадию центрифугирования. Затем выбросьте супернатант, оставив небольшое количество буфера в трубке.
Первичные ворота исключали обломки в прямом рассеянии по сравнению с боковыми участками рассеяния, а мертвые ячейки были впоследствии исключены. Второй ворота исключал клетки, положительные на основной белок миелина. А из оставшихся клеток были созданы графики плотности клеток, положительных для каждого фторхрома.
Частота каждой популяции нейрональных клеток была рассчитана из третьих ворот. Образцы, обработанные ручной механической диссоциацией и ферментативным пищеварением, дали значительно меньшую популяцию интересующих клеток, тогда как свежие, так и фиксированные образцы, обработанные автоматизированной механической диссоциацией и ферментативным пищеварением, показали в несколько раз более высокую популяцию клеток, представляющих интерес. В то время как этапы перфузии и удаления мусора могут быть сложными на начальном этапе, поддержание гладкой и устойчивой руки может помочь обеспечить успех.
