Протокол позволяет визуализировать изменения во второй реструктуре ДНК, индуцированной АТФ-зависимыми белками ремоделирования хроматина. Изменение структуры ДНК может быть коррелировано с регуляцией транскрипции. Это простой и высокочувствительный метод, который использует очень небольшое количество чистой ДНК для регистрации структурных изменений в олигонуклеотиде.
Этот метод может дать представление о регуляции транскрипции, опосредованной АТФ-зависимыми белками ремоделирования хроматина. Для начала подготовьте рабочие концентрации буферов и других компонентов реакции свежими и держите их на уровне четырех градусов Цельсия перед настройкой реакций, затем измерьте АТФазную активность белка в присутствии различных молекул ДНК с помощью анализа окисления, связанного с NADH. Смешайте 0,1 миллимоляра ADAAD, два миллимоляра АТФ, 10 наномолярных ДНК и 1X буфер REG в 96-луночной пластине с конечным объемом 250 микролитров.
Затем инкубируйте реакцию в течение 30 минут в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия, затем измерьте количество NAD+ с помощью программного обеспечения, поставляемого вместе со считывателем микропластин. Чтобы измерить поглощение на 340 нанометрах, нажмите на анализ NADH и поместите 96-луночную пластину на держатель пластины в инструменте, затем нажмите кнопку считывания пластины, чтобы записать поглощение. Соберите спектры CD в высокопрозрачные кварцевые кюветы.
Используйте либо прямоугольные, либо цилиндрические кюветы. Чтобы очистить кюветы, вымойте их водой несколько раз, затем сделайте сканирование воды или буфера в кювете, чтобы проверить, чиста ли она. Для реакций используют очищенные PAGE олигонуклеотиды ДНК.
Для быстрого охлаждения нагрейте ДНК при 94 градусах Цельсия в течение трех минут на нагревательном блоке и сразу же охладите ее на льду. Для медленного охлаждения, после нагрева ДНК при 94 градусах Цельсия в течение трех минут, дайте ей остыть до комнатной температуры со скоростью один градус Цельсия в минуту. Чтобы записать базовые спектры, настройте в общей сложности пять контрольных реакций одна за другой в 1,5-миллилитровых центрифужных трубках.
Держите реакционный объем на уровне 300 микролитров во всех реакциях. Чтобы записать спектры CD, наладите в общей сложности пять экспериментальных реакций одна за другой в 1,5-миллилитровых центрифужных трубках. Чтобы записать сканирование, включите газ и включите CD-спектрометр.
Через 10-15 минут включите лампу, включите водяную баню и установите температуру держателя на уровне 37 градусов цельсия. Затем откройте программное обеспечение спектра компакт-дисков и установите температуру на 37 градусов цельсия, диапазон длин волн от 180 до 300 нанометров, время на точку до 0,5 секунды и номер сканирования на пять, затем нажмите на просмотрщик данных pro, создайте новый файл и переименуйте его с деталями эксперимента и датой. Затем смешайте исходные и экспериментальные реакции путем пипетирования и осторожно перенесите реакционные смеси одну за другой на кювету, убедившись, что в ней нет пузырьков воздуха.
Если вы проводите эксперимент с временным курсом, инкубируйте реакции при 37 градусах Цельсия в течение необходимого времени, затем пройдите сканирование. Добавьте ЭДТА в буфер, содержащий ДНК, АТФ, магний и белок, чтобы остановить гидролиз АТФ. Чтобы полностью ингибировать активность АТФазы, увеличивают концентрацию ЭДТА и время инкубации.
Вычтите исходные линии из соответствующих реакций в программном обеспечении и сгладьте данные либо в программном обеспечении спектра компакт-дисков, либо в программном обеспечении для построения данных, затем постройте график длины волны против средней эллиптичности остатка и проанализируйте пики. М-складки показали, что обе нити ДНК MYC могут образовывать стволовую петлообразную структуру. Здесь показаны М-складные структуры прямой и обратной последовательности ДНК, содержащей G-квадруплекс GECE.
CD-спектры быстро охлаждаемого GECE в отсутствие и присутствии ATP и ADAAD показали, что ADAAD индуцирует два положительных пика, один на 258 нанометров, а другой на 210 нанометров. Добавление ЭДТА отменяет это конформационное изменение. Спектры CD теперь имеют отрицательный 210-нанометровый пик и широкий положительный диапазон с пиками в 230 и 250 нанометров.
QGRS mapper и M-fold анализ показали, что промоторные области DROSHA, DGCR8 и DICER обладают потенциалом для формирования G-квадруплексных и стволовых структур. Спектры CD пятой пары DROSHA показали, что ADAAD индуцирует отрицательный пик в 210 нанометров и положительный пик в 260 нанометров. Этот спектр является характеристикой ADNA.
Спектры CD DGCR8 первой пары показали положительный пик в 210 нанометров и широкий отрицательный пик в 260 нанометров. Этот спектр характерен для перехода от B к X. Для пары DGCR8 семь были замечены сильные положительные пики на 210 и 270 нанометрах и отрицательный пик на 250 нанометрах.
Этот спектр характерен для параллельных структур G-квадруплексной ДНК. Наконец, для пары DICER один наблюдал положительный пик на 210 нанометров и два отрицательных пика, один на 230 нанометров, а другой на 260 нанометров. Эти пики характерны для перехода ДНК от А к X.
Убедитесь, что чистота ДНК и белка составляет 99% и более. Кюветка должна быть чистой, а базовая линия должна быть меньше одной миллидегри. Все реагенты должны быть чистыми, чтобы фон составлял менее одной миллидегри.
