Протокол разработан для производства полноразмерных охотничьих вариантов в низком миллиграммовом масштабе. Это позволяет получать стабильный высококачественный белок, необходимый для исследователей БГ. Продемонстрировать процедуру будет Майкл Харрис, ученый-исследователь из Лаборатории Курии.
Начните с добавления одного грамма полиэтиленимина 25 К к одному литру воды без эндотоксинов и хорошо перемешайте. Отрегулируйте рН до 2,0 с помощью 100-миллимолярной соляной кислоты и перемешивайте до тех пор, пока не растворится весь полиэтиленимин. Затем отрегулируйте рН до 7,0 с помощью 100-миллимолярного раствора гидроксида натрия и пропустите раствор через 0,2-микрометровый фильтр.
Сделайте аликвоты из фильтрованного раствора и храните их при минус 20 градусах Цельсия. Размножают клетки HEK293 в питательной среде, дополненной пенициллином стрептомицином, в увлажненном шейкерном инкубаторе при 37 градусах Цельсия, 90 об/мин, 5% углекислого газа в течение 18-24 часов. За сутки до трансфекции разводят клетки при плотности около 1,2 х 10 до шестой мощности клеток на миллилитр в двух литрах питательной среды в пятилитровой колбе Эрленмейера и инкубируют в течение 18-24 часов.
В конце инкубации измерьте плотность и жизнеспособность клеток с помощью счетчика автоматических клеток, следуя инструкциям производителя. После расчета количества полиэтиленимина и плазмиды, необходимого для трансфекции, разводят полиэтиленимин и плазмиду по отдельности в 100 миллилитрах PBS и инкубируют при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем смешайте разбавленную плазмиду и полиэтиленимин, осторожно закручивая и инкубируя смесь при комнатной температуре в течение 30 минут.
Добавьте смесь в культуру клеток и перемешайте, осторожно закручивая. Теперь позвольте клеткам расти в течение 24 часов. На следующий день добавляют раствор бутирата натрия к конечной концентрации двухмиллимолярного антикомпаундирующего и антипенного агента в объемном соотношении 1:1 000 к культуре и инкубируют клетки в увлажненном шейкерном инкубаторе в течение 48 часов.
После измерения жизнеспособности и плотности клеток собирают клетки путем центрифугирования при 2000 Г в течение 30 минут и хранят гранулы клеток при минус 80 градусах Цельсия перед очисткой. Для анти-FLAG очистки с использованием FPLC упакуйте от 12 до 25 миллилитров смолы anti-FLAG на пустую колонну со скоростью потока четыре миллилитра в минуту, используя буфер A, и отрегулируйте высоту плунжера, чтобы удалить зазор между концом плунжера и слоем смолы. Затем суспендируйте размороженную ячейку гранулы в буфере холодного лизиса и пропустите клеточную суспензию один раз через гомогенизатор с высоким сдвигом при давлении 1000 фунтов на квадратный дюйм.
Используя центрифугу, оснащенную совместимым ротором с фиксированным углом, осветите лизат при 20 000 G в течение одного часа. Программируйте FPLC в окне Метод, загрузите очищенный лизат через насос для образцов и промывайте колонку желаемыми объемами колонки буфера A, B, C, D и буфера элюирования, как описано в текстовой рукописи. После завершения прогона проанализируйте 10 микролитров пиковых фракций с помощью SDS-PAGE.
Объедините пиковые фракции с желаемой чистотой и сохраните около 50 микролитров комбинированных элюатов для дальнейшего анализа SDS-PAGE. Начните уравновешивать колонну SEC с помощью FPLC и загружайте элюат anti-FLAG через 50-миллилитровый суперпетлю. После запуска буфера SEC позвольте разделению SEC происходить ночью при четырех градусах Цельсия.
Сравните профиль элюирования со стандартным профилем элюирования HTT, чтобы различить мономерные, димерные и олигомерные пики более высокого порядка. Объединяйте мономерные фракции HTT на основе профиля элюирования колонны SEC и, при желании, объединяйте олигомерные и димерные фракции HTT более высокого порядка отдельно. Сконцентрируйте объединенный белок HTT с помощью центробежного концентратора мощностью 100 килодалтонов при четырех градусах Цельсия.
После расчета концентрации белка аликвотирует менее 100 микролитров очищенного белка HTT в криобезопасной микроцентрифужной трубке. Вспышка замораживает аликвоты с помощью жидкого азота и хранит их при минус 80 градусах Цельсия. Выполняйте все аналитические SEC-MALS при четырех градусах Цельсия в системе ВЭЖХ в сочетании с УФ-детектором, многоугольным детектором рассеяния света, детектором дифференциального показателя преломления и используйте 0,185 в качестве приращения показателя преломления для HTT.
Продувите насос и детекторы отфильтрованной водой класса ВЭЖХ и подключите колонну UHPLC к системе. Уравновешивайте колонну фильтрованной водой, а затем буфером SEC-MALS до тех пор, пока все сигналы детектора не достигнут исходной линии. Вводят два микролитра раствора BSA со скоростью потока 0,3 миллилитра в минуту в течение 15 минут на инъекцию.
Проверьте качество данных, выполните нормализацию, выравнивание пиков и коррекцию расширения диапазона на основе профиля BSA и создайте шаблон для следующих запусков образцов HTT. Быстро разморозьте флакон образца FL Q23-HTT на водяной бане комнатной температуры с помощью поплавка. Отфильтруйте HTT через 0,1-микрометровый спин-фильтр.
Введите от двух до четырех микролитров образца HTT и работайте в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия со скоростью потока 0,3 миллилитра в минуту. Проанализируйте хроматографические данные и данные рассеяния света с помощью сопутствующего программного обеспечения и сгенерируйте график Зимма для определения усредненной по весу молекулярной массы для каждого пика. В настоящем исследовании с использованием двухстадийного колонного процесса для HTT было получено более 95% чистоты, а основным загрязнителем был шаперон Hsp70, который был устранен путем обширной промывки хлоридом магния и АТФ во время стадии очистки анти-FLAG сродства Сверхэкспрессия FL HTT может привести к фрагментации белка, но FL Q23-HTT, полученный методом, разрешенный как одна полоса с правильной молекулярной массой 350 килодальтон, указывает на отсутствие фрагментация.
Анализ вестерн-блоттинга после реакции антител с FL Q23-HTT показал, что белок был выделен без значительных обнаруживаемых усечений, так как никаких дополнительных полос, связанных с фрагментами, не наблюдалось. Дисперсия длины поли-Q FL HTT, Q23, Q48 и Q73 реагировали, как и ожидалось, в западном блотте, демонстрируя постепенно более сильный сигнал для поли-Q-направленного моноклонального антитела MW1, коррелируя с увеличением длины Q. Среди протестированных колонок ВЭЖХ колонна SEC показала достаточное разрешение между мономером HTT и димером, так что можно было различить молярные массы.
Очищенный FL HTT от SEC показал несколько полос, соответствующих состояниям олигомеризации, что может быть связано с наличием нескольких гидрофобных пятен, которые способствуют образованию олигомеров более высокого порядка во время миграции внутри геля. Очищенный HTT показал три основные полосы на синем нативном PAGE с оценочной молекулярной массой 643, 927 и 1 070 килодальтон, которые, вероятно, представляют мономерные, димерные и тримерные виды HTT, соответственно. Правильное обращение с очищенным гентингтином имеет важное значение для предотвращения образования высокоупорядоченных олигомеров в растворимых агрегатах.
Крайне важно, чтобы конечный пользователь работал быстро, чтобы дозировать образец в предварительно охлажденные пробирки перед мгновенной заморозкой. Долгосрочные испытания на стабильность могут быть выполнены на образцах, хранящихся в течение длительных периодов времени при минус 80 градусах Цельсия. Повторный анализ ВЭЖХ SEC-MALS подтвердит, произошли ли какие-либо изменения в мономерном содержании образца.
