Этот протокол позволяет обнаруживать новые нематициды для борьбы с Ditylenchus dipsaci с помощью метода культивирования и химических экранов со средней пропускной способностью. Простота этого метода позволяет проводить скрининг тысяч соединений в неделю для выявления соединений с нематицидным потенциалом. Этот метод может идентифицировать новые соединения, чтобы убить растительно-паразитических нематод сельскохозяйственных культур и, следовательно, увеличить глобальное снабжение продовольствием.
Для начала приготовьте 500 миллилитров питательного агара, или NA-среды, с 23 граммами на литр NA и сверхчистой водой. Используя стерильную технику, насыпьте 25 миллилитров автоклавной среды NA в 20 одноразовых чашек Петри диаметром 100 миллиметров, глубиной 15 миллиметров. Приготовьте 500 миллилитров среды Gamborg B5 или GA, содержащей 3,2 грамма на литр базальной среды GA с минимальной органикой, 20 граммов на литр сахарозы, 15 граммов на литр агара и дистиллированной воды.
Используя стерильную технику, налейте 50 миллилитров автоклавной среды GA в 10 одноразовых чашек Петри. Для выполнения стерилизации семян налейте 150 семян гороха в стерильный двухлитровый стакан с перемешивателем возле пламени горелки Бунзена на лабораторной скамье. Добавьте 200 миллилитров 95% этанола в семена и энергично перемешайте на перемешиваемой пластине в течение пяти минут.
Затем вылейте этанол в контейнер для отходов. Налейте отбеливающий раствор в стакан, чтобы полностью погрузить семена. Энергично перемешайте на тарелке для перемешивания в течение 20 минут.
Затем вылейте отбеливатель в контейнер для отходов. Налейте дистиллированную воду в стакан, чтобы погрузить семена и энергично перемешайте на тарелке для перемешивания в течение 20 минут. После окончательного промывания водой вылейте стерилизованные семена в стеклянную чашку Петри.
Чтобы проверить наличие загрязнений, переложите шесть семян на каждую 10-сантиметровую na пластину в ламинарной вытяжке с помощью стерилизованных щипцов. Расположите семена по окружности тарелки. Оберните пластины по отдельности в лабораторную пленку и высиживайте их в темноте в течение трех дней при температуре 26 градусов Цельсия.
В ламинарной проточной вытяжке обложите два незагрязненных семени на каждой пластине GA стерилизованными щипцами. Инкубировать при комнатной температуре в течение 7-10 дней, чтобы семена проросли. Приготовьте 50 миллилитров раствора сахарозы по 20 грамм на литр.
Фильтр стерилизуют раствор сахарозы и откладывают в сторону. В ламинарной вытяжке вырежьте кусок агара, содержащего корневую ткань, из существующей культуральной пластины. Пипетка 500 микролитров раствора сахарозы на новую пластину ГА с рассадой гороха и поместите кубик агара поверх сахарозы.
Выдерживайте культуру в коробке, облицованной алюминиевой фольгой, при комнатной температуре. Чтобы сохранить культуру, субкультуру нематод на свежих пластинах GA каждые восемь-девять недель. Нематоды готовы к добыче примерно через восемь недель.
В ламинарном проточном капюшоне нарежьте агар и корневую ткань на сантиметровые кубики стерильным скальпелем. Переложите кубики агара в воронку с фильтром для кофе и медленно налейте дистиллированную воду на агар, чтобы смочить кофейный фильтр. Извлеките воронку с фильтром кофе из стакана и наполните стакан дистиллированной водой до тех пор, пока уровень воды не коснется нижней части фильтра после замены воронки с фильтром для кофе.
Накройте воронку с фильтром для кофе и стакан алюминиевой фольгой. Чтобы собрать червей, удалите воронку с фильтром кофе и аспирируйте верхние 40 миллилитров воды из стакана сбора, не нарушая осевших червей. Соберите оставшуюся жидкость в 15-миллилитровую коническую центрифужную трубку с 10-миллилитровой пластиковой серологической пипеткой.
Для приготовления пробирных пластин насыпьте автоклавно-дистиллированную воду в стерильный желоб и дозируйте 40 микролитров дистиллированной воды из корыта в каждую скважину плоскодонной 96-луночной пластины с многоканальной пипеткой. Добавьте химические вещества из 96-луночных химических пластин в пробирные пластины, прикрепив три раза к химической пластине. Затем переложите штифты 10 раз в пробирную пластину.
Промокните на бумаге перед чистящим раствором. Чтобы подсчитать количество нематод из коллекции, сначала повторно приостановите коллекцию, а затем пипетку пять микролитров раствора, используя наконечники с низким удержанием, на слайд. Подсчитайте количество нематод в пяти микролитрах с помощью рассеченного микроскопа.
Затем отрегулируйте концентрацию до двух червей на микролитр, используя стерильную дистиллированную воду. Далее добавляем 10 микролитров образца в каждую скважину из 96-луночных плит с многоканальной пипеткой и желобом. Оберните тарелки влажным бумажным полотенцем и поместите их в коробку.
Затем добавьте дополнительное влажное бумажное полотенце для стабилизации и обеспечения минимального движения пластин и прикрепите на липкую прокладку в встряхивающемся инкубаторе с температурой 20 градусов цельсия, установленном на 200 оборотов в минуту. Понаблюдайте за пластинами на пятый день под рассекающим микроскопом. Подсчитайте количество мобильных и общих D.dipsaci в системах контроля растворителей ДМСО и обработанных лекарственными средствами скважинах.
Если черви неподвижны, добавьте в лунку два микролитра одномолярного гидроксида натрия до конечной концентрации 40-миллимоляра, чтобы стимулировать движение. Рассчитайте долю мобильных червей. В экранах D.dipsaci скважины, которые воспроизводимо давали 0% мобильных червей, классифицируются как сильные попадания.
Три различные лекарственные пластины были проверены в концентрации 60-микромоляров, где каждая лекарственная пластина имеет три биологические реплики. Все три пластины включали 6% dmSO-только растворителей. Во многих пластинах, содержащих лекарства из библиотеки малых молекул, отсутствовала какая-либо молекула с наблюдаемой биологической активностью против D.dipsaci.
Некоторые пластины имели полностью воспроизводимые хиты, в то время как другие, содержащие характерные нематоциды, различались по своей активности. Полосы погрешностей представляют стандартную погрешность среднего значения. Здесь флуопирам проявил устойчивую активность в анализе.
Флуопирам индуцировал кажущееся дозозависимое влияние на подвижность D.dipsaci с EC50 9,3-микромоляром. Оксамил не оказывал существенного влияния на подвижность до 120-микромолярной концентрации. Оксамил не оказывал существенного влияния на подвижность вплоть до концентрации 120-микромолярного.
Добавление гидроксида натрия улучшило чувствительность анализа при обнаружении неподвижных червей. 40-миллимоляр гидроксида натрия использовался в качестве конечной точки анализа для стимуляции движения у способных особей, и, таким образом, отличить покоящихся червей от больных червей. Этот протокол позволил идентифицировать соединения с новыми механизмами действия против D.dipsaci и других видов.
