Было показано, что глобальная динамика хроматина является важным медиатором нескольких болезненных состояний, таких как рак и старение. Наш протокол предоставляет физиологически значимую модель для изучения этого процесса. Стандартный лабораторный анализ посттрансляционных модификаций гистонов или PTMS обычно ограничивается зондированием одного ПТМ за один раз с использованием анализов на основе антител.
Жидкостная хроматографическая масс-спектрометрический анализ гистонов ПТМС позволяет измерить обилие сотен ПТМС за один эксперимент. Продемонстрировать процедуру будут Стефани Странски, Рональд Катлер и Джули Ким, постдок, аспирант и научный техник, соответственно, из лаборатории. Во-первых, используя стандартные питательные среды, выращивайте клетки как монослой до тех пор, пока они не станут на 80% сливающимися.
Затем промыть клетки HBSS. Добавьте пять миллилитров 0,05% трипсина-ЭДТА, разведенных в HBSS. Инкубируйте клетки в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом.
Используйте микроскоп для проверки отслоения клеток. После подсчета клеток разбавьте клеточную суспензию свежими питательными средами. Добавьте 0,5 миллилитра питательной среды, чтобы уравновесить сверхнизкую прикрепленную 24-луночную круглодонную пластину с несколькими микролунками в каждой.
Затем центрифугируют пластины при 3000 х г, чтобы удалить пузырьки воздуха с поверхности пластины. Теперь переложите ранее изготовленную клеточную суспензию на 24-луночную пластину и центрифугу на три минуты при 120 х г. Проверьте клетки в 24-луночной пластине, а затем инкубируйте пластины при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом в течение 24 часов для образования сфероидов.
Между тем, чтобы уравновесить биореактор, добавьте 25 миллилитров стерильной воды в камеру влажности и девять миллилитров питательных сред в камеру клеток. Инкубируйте биореактор во вращающемся клиностатном инкубаторе в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Отсоедините сфероиды от сверхнизкой 24-луночной пластины путем осторожного пипетирования с использованием одного миллилитра широких наконечников отверстия и перенесите их в чашку для культуры тканей.
Чтобы выбрать достаточно форм сфероидов, проверьте качество сфероидов под микроскопом. Сфероиды хорошего качества имеют равномерный размер, компактность и округлость. Заполните уравновешенный биореактор пятью миллилитрами свежих питательных сред и перенесите в него сфероиды.
Затем заполните биореактор полностью свежими питательными средами и поместите биореактор в инкубатор клиностата при 10-11 оборотах в минуту. Каждые два-три дня обменивайтесь питательными носителями, заменяя 10 миллилитров старых носителей свежими носителями. По мере того, как сфероиды увеличиваются в размерах и количестве, увеличивают скорость вращения инкубатора.
После получения сфероидной гранулы добавьте пять объемов холодной 0,2 молярной серной кислоты в гранулу и пипетку вверх и вниз, чтобы разрушить гранулу и высвободить гистоны. После получения супернатанта после центрифугирования добавляют холодную концентрированную трихлоруксусную кислоту, так что конечная концентрация становится от 25 до 30% объема по объему. И смешайте его, перевернув трубку несколько раз и центрифугу, как описано в рукописи.
После выброса надосадочного вещества, используя стеклянную пастбищную пипетку, промыть гранулу и стенки трубки примерно 500 микролитрами холодного ацетона и 0,1% соляной кислоты, а затем центрифугу при 3 400 х г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Затем переверните трубку, чтобы выбросить супернатант. Используя стеклянную пастбищную пипетку, добавьте 500 микролитров 100% холодного ацетона для промывки гранул и центрифуги, как было продемонстрировано ранее.
После выброса супернатанта полностью удалите ацетон путем тщательной пипетки и дайте образцу высохнуть с открытой крышкой в течение примерно 20 минут. Повторно суспендировать гранулу в 20 микролитрах от 15 до 20% ацетонитрила в 100-миллимолярном бикарбонате аммония рН 8. После вихря открутите суспензию на 1000 х g в течение 30 секунд.
Для восьми или более образцов перенесите каждый повторно взвешенный образец на 96-луночную пластину. Затем в вытяжку добавляют два микролитра пропионового ангидрида и перемешивают путем пипетирования пять раз. Быстро добавьте 10 микролитров гидроксида аммония и перемешайте путем пипетки пять раз.
Смешайте HLB-смолу на магнитной перемешиваемой пластине. Затем добавьте 70 микролитров суспензии HLB в каждую скважину фильтрующей пластины из 96 скважин на 96-луночной коллекторной пластине. После отбрасывания потока промыть смолу 100 микролитрами 0,1% трифторуксусной кислоты.
После повторного использования каждого образца в 100 микролитрах 0,1% трифторуксусной кислоты загрузите каждый образец в каждую скважину и предотвратите разбрызгивание с помощью вакуума. После отбрасывания потока промыть образцы 100 микролитрами 0,1% трифторуксусной кислоты и поместить фильтрующую пластину на новую пластину сбора. Затем добавьте 60 микролитров 60% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоты в каждую лунку и предотвратите разбрызгивание с помощью вакуума.
Соберите поток и высушите в вакууме со скоростью. Загрузите высушенную коллекционную пластину в ВЭЖХ и запустите метод LC/MS/MS, как описано в рукописи. В этом исследовании относительное обилие общих посттрансляционных модификаций гистона наблюдалось в гепатоцитах C3A, выращенных в виде трехмерных сфероидов.
Посттрансляционные модификации также могут наблюдаться на одном остатке в пептидах, полученных из гистоновых белков. Лечение сфероидов бутиратом натрия увеличивало относительное обилие ацетилирования гистонов, тогда как лечение сукцинатом натрия усиливало сукцинилирование гистонового остатка. Метод также продемонстрировал схему распределения ацетилирования гистонов после обработки бутиратом натрия и сукцинилирования гистонов после обработки сукцинатом натрия.
Результат также показал общие паттерны различных модификаций гистонов. Обработка бутиратом натрия значительно усиливала ацетилирование остатка лизина 14 на пептиде, полученном из гистонового белка H3, только тогда, когда его девятый остаток лизина имел две метильные группы, но не одну или три метильные группы. Также было рассчитано относительное обилие отдельных модификаций и различных комбинаций посттрансляционных модификаций в пептиде, полученном из H3.
Комбинаторные паттерны посттрансляционных модификаций после обработки бутиратом натрия также наблюдались в пептиде, полученном из гистонового белка H4. Здесь также лечение бутиратом натрия привело к значительному увеличению ацетилирования. Критическое внимание следует уделять тому, чтобы сфероиды находились на скамейке как можно меньше и на стадии обессоливания, чтобы избежать разлива образца. Этот рабочий процесс может быть использован для исследования хроматина в твердых тканях с использованием более физиологической модели, чем быстро реплицирующиеся плоские клеточные культуры.
