Взаимодействие токсинов морского анемона должно использовать наименьшее количество организмов и эффективные протоколы для получения большого разнообразия и обилия токсинов и быстрой идентификации конкретного токсина. Мы объединили два эффективных метода приготовления сырого экстракта с большим количеством белка и описали воспроизводимые, специфические, быстрые и недорогие анализы для выявления гемолиза и фосфоловых оснований в яде морского анемона. Метод может быть использован практически в любом примере, в котором принято решение идентифицировать один или оба типа цитолизинов.
Эффективность метода достигается за счет заботы о времени на каждом этапе при приготовлении сырого экстракта. Ключом к гемолизу является бережное обращение с эритроцитом, чтобы избежать механического лизиса, и в фосфолизном анализе, заботясь о температуре при приготовлении пластины. Демонстрировать процедуру будут доктор Сантос Рамирес-Каррето, биолог Сандра Салазар Гарсия и биолог Джованни Масиас Мартинес из моей лаборатории.
Начните с очистки собранного морского анемона A.doi дистиллированной водой вручную, чтобы удалить крупные частицы субстрата, прилипшие к телу. Немедленно заморозьте организмы при минус 80 градусах Цельсия в ультрафризоре в течение 72 часов. Затем поместите организмы в специальные стаканы для сублимационной сушки с условиями лиофилизации на 48 часов.
Для гидратации тканей восстановите 20 грамм сухой массы лиофилизированных организмов с 60 миллилитрами 50-миллимолярного буфера фосфата натрия и одной таблеткой коктейля ингибитора. В магнитной мешалке непрерывно перемешивайте образец при частоте около 800 об/мин и четырех градусах Цельсия в течение 12 часов. После замораживания образца при минус 20 градусах Цельсия в течение 12 часов, чтобы вызвать лизис клеток и сброс нематоцисты, поместите контейнер в воду комнатной температуры, пока он не оттаяет до 90%Повторите эту процедуру три раза.
Для уточнения экстракта центрифугируют образец при 25, 400 G в течение 40 минут при четырех градусах Цельсия. Извлеките супернатант и снова центрифугируйте его. Повторите шаг три-четыре раза и, наконец, восстановите супернатант.
Восстановленный супернатант или сырой экстракт содержит компоненты яда и другие клеточные молекулы, такие как липиды, углеводы и нуклеиновые кислоты. Определите концентрацию белка в сыром экстракте с помощью коммерческого набора колориметрического анализа Брэдфорда. Инкубируйте образцы в течение пяти минут при комнатной температуре без встряхивания.
Затем измерьте поглощение на 595 нанометрах. Постройте средние значения поглощения BSA образца и определите уравнение графика, где y — поглощение, m — наклон линии, x — концентрация белка, а b — ордината к началу. Чтобы проанализировать сырой экстракт, добавьте 30 микрограммов сырого экстракта к пяти микролитрам буфера загрузки белка, чтобы денатурировать белки.
Конечный объем должен быть менее 50 микролитров. Проводят электрофорез при константе 25 миллиампер в течение одного часа 30 минут. Чтобы избежать диффузии гелевых белков, добавьте к белкам раствор для фиксации и инкубируйте при комнатной температуре в течение 40 минут с встряхиванием при 80 об/мин.
Затем декантируют раствор и добавляют раствор для сшивания белка. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре с встряхиванием при 80 об/мин. Вынуть раствор и промыть гель 100 миллилитрами дистиллированной воды в течение пяти минут.
После этого удалите воду и повторите эту процедуру четыре раза. Проводят окрашивание белка 50 миллилитрами фильтрованного раствора Coomassie Brilliant Blue R-250, перемешивая при 60 об/мин в лабораторном ротационном генераторе при комнатной температуре в течение 15 минут. Извлеките один миллилитр крови из яремной вены овцы и извлеките иглу из шприца.
Немедленно слить кровь в пробирку с 50 миллилитрами раствора Alsever и центрифугу в 804 раза больше G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Отбросьте супернатант и добавьте 30 миллилитров раствора Alsever, скользя им по внутренним стенкам трубки. Медленно повторно суспендируйте гранулу с помощью пластиковой пипетки Пастера и снова центрифугируйте раствор в 804 раза G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока не прояснится супернатант. Поддерживайте конечный объем раствора Alsever для достижения концентрации примерно 2 миллиона клеток на миллилитр. Затем используйте камеру Нойбауэра или гемоцитометр для подсчета клеток.
Инкубируйте смесь раствора в течение одного часа при 37 градусах Цельсия без встряхивания, а затем центрифугируйте пластину в 804 раза G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Восстановите супернатант в другой 96-луночной плите с плоским дном. Если сырой экстракт содержит цитолизины, эритроциты будут лизироваться и высвобождать гемоглобин.
Считайте абсорбцию на 415 нанометров и рассчитайте количество экстракта, который производит гемолиз в 50% эритроцитов. Увеличьте количество сырой добычи морских анемонов и спроектируйте участок с сигмоидальными корректировками с помощью соответствующего программного обеспечения. Вымойте одно куриное яйцо с 1% SDS в дистиллированной воде и отделите яичный желток от яичного белка в стерильных условиях.
Приготовьте растворы A, B, C и D.Добавьте 500 микролитров растворов A и C к раствору B и 100 микролитров раствора D.Смешайте их и налейте по 25 миллилитров в каждую чашку Петри. Дождитесь затвердевания раствора в стерильных условиях и сделайте лунки диаметром примерно два-три миллиметра тонкой трубкой. Добавьте в общей сложности 20 микролитров фосфатного буфера в качестве отрицательного контроля в одной лунке и 20 микролитров определенной фосфолипазы в качестве положительного контроля в другой скважине.
Поместите различные количества сырого экстрактного белка 5, 15, 25, 35 и 45 микрограммов в оставшиеся скважины, каждый в конечном объеме 20 микролитров. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 часов. Репрезентативные результаты протокола, использованного для получения сырого экстракта морского анемона, показали, что сочетание двух методов, перемешивания и циклов замораживания и оттаивания, приводит к эффективному сбросу нематоцист.
Здесь показаны нематоциты до и после раздражителей. Каналец нематоцисты обнажается на этом изображении, что указывает на высвобождение токсина. Электрофоретический профиль сырого экстракта морского анемона показан здесь.
Сырой экстракт морского анемона был проанализирован 15%-ным полиакриламидным гелем SDS-PAGE и показал белок от 10 килодалтон до 250 килодалтон молекулярной массы. Здесь полоса 1 - это белковая лестница, а полоса 2 - яд морского анемона. Цитолизины были обнаружены в молекулярно-весовой зоне 15 килодалтон и 20 килодалтонов.
Здесь показан анализ гемолиза в эритроцитах овец. Гемолитическая активность экстракта до и во время циклов замораживания и оттаивания увеличивалась до тех пор, пока не был достигнут 100% гемолиз с 50 микрограммами общего белка сырого экстракта в последних двух циклах. Количество, необходимое для лизирования 50% эритроцитов овец, составляет 11,1 0,3 мкг на миллилитр.
Активность фосфолипазы была обнаружена путем образования прозрачных ореолов в областях агаровой пластины, где был применен образец сырого экстракта. Результаты показывают наличие активности фосфолипазы от 15 мкг общего белка. Диаметр ореола увеличивался дозозависимым образом, то есть, если количество сырого экстракта увеличивалось, диаметр ореола увеличивался.
При попытке процедуры обязательно индуцируйте разряд нематоцисты, количественно оцените общий белок, проанализируйте сырой экстракт с помощью электрофореза SDS-PAGE, рассчитайте количество сырого экстрактного белка для производства 50% гемолиза и используйте различные количества белка в анализе фосфолипазы. Мы можем проанализировать сырой экстракт протеомным методом, чтобы идентифицировать полипептиды, имеющие большое значение в биотехнологии и биомедицине, даже профилировать и охарактеризовать уникальную молекулу, а затем произвести ее в лаборатории для применения. Получена часть последовательности выступающего белка с противоопухолевой активностью в эпителиальных клетках прикарциномы легкого человека.
Точно так же мы идентифицируем последовательность фосфолипаз, представляющих биотехнологический интерес.
