Этот протокол может быть использован для оценки целостности и пластичности нервно-мышечного соединения в нормальных и патологических условиях. Этот метод заключается в одновременной маркировке шванновских клеток и до- и после лабораторных животных на отдельных мышечных участках. После усыпления взрослого самца крысы поместите крысу в капюшон и откройте грудную полость, чтобы получить доступ к сердцу с помощью ножниц и щипцов.
Вводят и внутривенно катетер из левого сердечного желудочка в сторону аорты и разрезают правого оракула. Далее начинают перфузию со 100 миллилитров 0,9% нормального физиологического раствора до тех пор, пока кровь, выходящая из правого оракула, не станет прозрачной. Затем продолжают перфузию с 250-300 миллилитрами 4% параформальдегида в 0,1 молярном фосфатном буфере или PB pH 7,4 в течение 10 минут.
После перфузии удаляют кожу двусторонней задней конечности с помощью хирургического лезвия и обнажают двусторонний седалищный нерв и медиальную икроножную мышцу. Тщательно рассекните двустороннюю медиальную икроножную мышцу от задней конечности с помощью лезвия и постфиксируйте всю мышцу в 10 миллилитрах 4% параформальдегида. Через два часа выводят мышцу из раствора и криопротектируют ее в 10 миллилитрах 25%-сахарозы в 0,1 молярного ПБ в течение одного дня при четырех градусах Цельсия.
После того, как мышечная ткань погружена в раствор сахарозы, зафиксируйте ее на стадии замораживания скользящей микротомной системы с использованием замороженной среды. Нарежьте мышцу горизонтально вдоль длинной оси мышцы толщиной 80 мкм. С помощью щетки аккуратно поместите семь криосекреций на скважину в шестилуночную культуральную пластину с 10 миллилитрами 0,1 молярного ПБ. Для флуоресцентного окрашивания инкубируют четыре секции на лунку с 1,5 миллилитрами 0,1 молярного ПБ, содержащими 75 микролитров 10% Тритона X 100 и 45 микролитров обычной ослиной сыворотки на орбитальном шейкере при 20 об/мин.
Через 30 минут переводят срезы в 1,5 миллилитра смешанного раствора первичных антител, содержащих кроликовую антинейронитевую нить 200, козий антивезикулярный ацетилхолиновый транспортер в 0,1 молярного ПБ, в 1%-ной нормальной ослиной сыворотке и 0,5% Тритона Х 100 и инкубируют в течение ночи при четырех градусах Цельсия. На следующий день промывайте секции три раза в течение пяти минут каждая по 0,1 молярного ПБ в орбитальном шейкере при 20 об/мин. После последней промывки инкубируют участок в смешанном растворе вторичных антител, содержащих ослиный антизаявласий AF 488 и ослиный антикозеляный AF 546, а также биомаркеры альфа-бунгаротоксина AF 647 и фаллоидина 350, содержащие в 0,1 М ПБ 1%нормальную ослиную сыворотку и 0,5 тритона х 100 в течение одного часа, Защита их от света.
После инкубации промыть участки в ПБ и установить их на предметное стекло микроскопа. Нанесите покровное стекло на участок, используя 50% глицерин в дистиллированной воде. Наблюдайте и изображайте образец с помощью системы фокусной визуализации, оснащенной 20-кратным субъективным объективом с числовой диафрагмой 0,75 и объективом 40 x с числовой диафрагмой 0,95.
Для многократной флуоресцентной визуализации установите длины волн возбуждения и излучения каждого биомаркера, как описано в текстовой рукописи. Установите разрешение захвата изображения на 640 х 640 пикселей. Далее задайте начальную и конечную фокальную плоскость.
Задайте размер шага в один или два микрона. Затем выберите шаблон глубины, захват изображения и серию Z. Для изображений с меньшим увеличением при 20 X захватывайте стековые изображения 40 Z с шагом в два микрона, используя точечное отверстие 105 микрон.
Выберите режим проекции или топографии и интенсивность проекции по оси Z, чтобы интегрировать все изображения в один фокус. Для изображений с более высоким увеличением при 40 X захватывайте стековые изображения 80 Z в размере шага в один микрон с зумом, установленным на два, и 105-микронным точечным отверстием. Интегрируйте все изображения в одном фокусе.
Реконструируйте изображения в трехмерном виде с помощью системы обработки изображений. Здесь демонстрируется репрезентативная пространственная корреляция медиальной икроножной мышцы с нейронитями 200 положительных нервных волокон, везикулярным ацетилхолиновым транспортером положительным пресинаптическим терминалом, альфа-бунгаротоксин-положительным постсинаптическим ацетилхолиновыми рецепторами, S100-положительным перисинаптическими шванновскими клетками, фаллоидин-положительными мышечными волокнами и мечеными DAPI клеточными ядрами. Нейрофиламент 200 положительных нервных волокон работали в пучке.
Эти нервные волокна давали ветви везикулярному переносчику ацетилхолина положительные пресинаптические окончания, которые образовывали зеркальную связь с альфа-бунгаротоксином положительными постсинаптическими ацетилхолиновыми рецепторами. Кроме того, S100 положительные перисинаптические шванновские клетки были обнаружены вокруг нейрофиламента 200 положительных нервных волокон вблизи пресинаптических окончаний. Пространственная корреляция была дополнительно продемонстрирована в трехмерном рисунке, показывающем подробные морфологические характеристики нервно-мышечного соединения с разных точек зрения.
Чтобы наблюдать больше изображений в мышечных отделах, важно разрезать мышцу горизонтально вдоль длинной оси толщиной 80 микрон.
