Стратегия исключения нейронов с использованием отрицательной сортировки FACS генерирует высококачественные показатели секвенирования РНК популяции клеток с низким содержанием, таких как нервные стволовые клетки, астроциты и олигодендроциты, для изучения их роли в модуляции нейрогенеза гиппокампа у взрослых. С помощью этого метода можно адаптировать выбор антител в затворе FACS, что делает этот протокол очень универсальным в решении различных биологических вопросов, связанных с зубчатой извилиной. Этот метод в первую очередь предназначен для исследования взрослой ниши гиппокампа.
Тем не менее, он может быть легко адаптирован для изучения других ниш стволовых клеток. Продемонстрировать процедуру будет Сара Ахмед де Прадо, научный сотрудник по постдокторантуре в Институте Фрэнсиса Крика. Для начала перенесите мозг, препарированный от усыпленной мыши, в 10-сантиметровую чашку Петри, наполненную ледяным PBS.
Затем поместите чашку Петри на лед и разрежьте мозг на две половины вдоль сагиттальной оси. С помощью скальпеля удалите мозжечок. Переместите половину мозга в новую 10-сантиметровую чашку Петри, помещенную на лед, содержащую ледяной PBS.
Рассекните зубчатую извилину, или DG, с помощью бинокля, и повторите этот шаг, чтобы получить второй DG из второй половины мозга. Переложите два DG в предварительно охлажденный гомогенизатор Dounce и добавьте 1 миллилитр буфера холодной гомогенизации, или HB. Гомогенизируйте ткань 10 ударами рыхлого пестика А, после чего следует 15 ударов плотного пестика В. Переложите гомогенат в предварительно охлажденную 15-миллилитровую трубку.
Промойте гомогенизатор Dounce 1 миллилитром холодного HB и соедините его с той же трубкой. Добавьте 3 миллилитра HB в 15-миллилитровую трубку и высиживайте в течение 5 минут на льду. Смешайте эту суспензию ядер дважды, осторожно перевернув трубку.
Используя 0,5 миллилитра HB, предварительно смочите 70-микрометровый колпачок сетчатого фильтра, помещенный в пробирку объемом 50 миллилитров, затем процедите суспензию ядер перед промывкой клеточного ситечка 0,5 миллилитра HB. Затем снимите клеточный ситечко и центрифугируйте пробирку в центрифуге с поворотным ведром при 500 х г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Выбросьте супернатант. Аккуратно повторно суспендируйте гранулу в 4 миллилитрах HB с помощью пипетки P1000.
После 5 минут инкубации на льду центрифугируют суспензию при 500 х г в течение 10 минут, при 4 градусах Цельсия. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 3 миллилитрах промывочной среды. Используйте 0,5 миллилитра моющих средств для предварительного смачивания 35-микрометрового сетчатого фильтра в пробирке с 50 миллилитров.
Затем процедите суспензию ядер, пипетируя 0,5 миллилитра суспензии за раз, используя пипетку P1000. После промывки крышки сетчатого фильтра 0,5 миллилитра промывочной среды поместите трубку на лед. Переложите фильтрат на новую 15-миллилитровую трубку и центрифугируйте его на 5 минут и 4 градуса Цельсия, при 500 х г.
Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 3 миллилитрах промывочной среды. Повторите центрифугирование и повторно суспендируйте гранулу в 1 миллилитре промывочной среды с мышиным анти-NeuN, Alexa Fluor 488-конъюгированным антителом и 1 микрограммом на миллилитр DAPI. Инкубировать реакцию в течение 45 минут на льду в темноте.
Для флуоресцентной активации сортировки ядер, или FANS, перенесите суспензию ядер с иммуноокрашенным оттенком в пробирку объемом 5 миллилитров и поместите ее на лед до начала процедуры проточной цитометрии. Вращайте образцы в течение 3 секунд, с умеренной интенсивностью, прежде чем поместить трубки в инструмент FACS. Чтобы получить данные от окрашенной суспензии ядер, установите затворы в ВЫСОТЕ DAPI и в области DAPI, чтобы исключить клеточный мусор и агрегированные ядра.
Затем установите затворы в области рассеяния на стороне бревна, или SSC, и области прямого рассеяния логарифмов, или FSC, чтобы отделить одиночные ядра от оставшегося окрашенного DAPI агрегата или клеточного мусора. Затем изолируйте NeuN-AF488-отрицательную популяцию, установив ворота для анти-NeuN-AF488 и FSC области. После анализа отсортируйте анти-NeuN-AF488 отрицательную популяцию в 1,5-миллилитровой коллекторной трубке, заполненной 50 микролитрами промывочной среды, используя стратегию затвора.
После того, как сортировка завершена, добавьте 1 миллилитр PBS, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина, или BSA, в коллекционную трубку, чтобы собрать капли со стенки трубки и центрифугировать трубку при 500 х г, в течение 5 минут, при 4 градусах Цельсия. Выбросьте супернатант, оставив 50 микролитров растворенного вещества для повторного суспендирования центрифугированных ядер. В микропробирке объемом 0,5 миллилитра добавьте 5 микролитров суспензии ядер к 5 микролитрам трипанового синего цвета.
Измерьте концентрацию и оцените жизнеспособность одноклеточной суспензии с помощью автоматизированного клеточного счетчика перед выполнением подготовки библиотеки и секвенирования ядер. Биоинформационная кластеризация выявила хорошо разделенные группы ядер, соответствующие известным типам клеток в пределах DG, с ИЛИ без FANS. В выборке, не отсортированной по FACS, большинство высококачественных секвенированных ядер составляли 84,9% нейронов.
Он состоял из трех групп нейронов, что указывает на возможность наиболее репрезентативных клеточных популяций в зубчатой извилине быть гранулярными нейронами, другими возбуждающими нейронами и тормозными нейронами. В образце, не отсортированном по FACS, идентифицированные ненейрональные кластеры были в основном составлены из 11,1% типов глиальных клеток, включая астроциты, олигодендроциты и клетки-предшественники олигодендроцитов, 3,3% иммунных клеток и 0,6% клеток Кахаля-Рециуса. При выполнении FANS для исключения NeuN-положительных популяций кластеры глиальных клеток стали заметными, с 81,3% от общего числа ядер.
Для образцов, секвенированных при 50 000 считываний на ядра, было обнаружено 25 010 генов на ядра для образца, не отсортированного по FACS, и 1 665,5 генов для NeuN-отрицательного образца FANS, что подтверждает высокое качество транскриптомного профилирования одиночных ядер и сортировка FACS не повреждает ядра для последующих snRNA-seq. Высокая доля нейронов в образце, не отсортированном по FACS, имела более высокую транскрипционную активность 2 660 генов на ядра и 6 170 транскриптов на ядро в образце, не отсортированном facS, чем ненейрональные типы клеток со средней транскрипционной активностью 1 090 генов на ядро и 1 785 транскриптов на ядро. После того, как данные были сгенерированы с помощью этого протокола, стоит рассмотреть эти новые ортогональные методы, такие как специальные симптомы или исследования in vivo, чтобы подтвердить любые результаты.
