Этот метод может помочь исследователям быстро и без усилий найти аномальные периоды развития эмбриона томата. Основным преимуществом данного протокола является обработка семян томатов гипохлоритом натрия, который обеспечивает основу для наблюдения за эмбрионами томатов. Начните с химической подготовки и сбора плодов Solanum lycopersicum через три-23 дня после цветения или DAF.
Сразу же выложить плоды на лед и разделить их на ранние, средние и поздние плоды, исходя из дней после цветения. Разбейте ранний плод, положите его на горку и тщательно соберите свежие семена с помощью точных щипцов под 1-4-кратным увеличением стереомикроскопа. Для средних и поздних плодов разбейте плоды и непосредственно соберите свежие семена с помощью прецизионных щипцов.
В обычном методе переложите свежесобранные семена немедленно в двухмиллилитровую центрифужную трубку, содержащую фиксатор FAA 1,5 миллилитра, и поместите трубку на орбитальный шейкер при 5 оборотах в минуту в течение четырех часов при комнатной температуре. Затем обезвоживают семена в 70% 95% и 100% этаноле в течение одного часа каждый на орбитальном шейкере со скоростью 5 оборотов в минуту. После этого поместите семя в три-пять капель очищающего раствора, присутствующего на слайде, и аккуратно накройте его крышкой.
Используйте один вогнутый слайд для средних и поздних семян. В зависимости от стадий развития семян, инкубируйте их при комнатной температуре для очистки. После инкубации наблюдают образцы с дифференциальным интерференционным контрастом или ОВС-микроскопом, оснащенным цифровой камерой с 10-кратным, 20-кратным и 40-кратным увеличением.
Отрегулируйте и оптимизируйте яркость пропускаемого света, ползунок DIC и диафрагму конденсатора в режиме реального времени для каждого образца и захват изображений. Переложите свежие семена, собранные из разбитых плодов, в двухмиллилитровую центрифужную трубку, содержащую 1,5 миллилитра дезинфицирующего раствора. Инкубируйте образцы на орбитальном шейкере при 30 оборотах в минуту в течение трех-50 минут при комнатной температуре.
Как только будет хорошо виден самый внутренний контур оболочки семян, отбросьте дезинфицирующий раствор. Для средних и поздних семян перенесите семена на горку. Используйте щипцы и рассекающую иглу для удаления семенной слизи под 1-4-кратным увеличением стереомикроскопа.
Перенесите семена обратно в исходную центрифужную трубку с помощью щипцов. Вымойте их пять раз в 1,5 миллилитрах деионизированной воды в течение 10 секунд каждый и выбросьте деионизированную воду. Далее добавьте к семенам двойной объем очищающего раствора.
В зависимости от стадии семени, давайте прерывистую вакуумную обработку в течение от нуля до 50 минут, с интервалом в 10 минут после каждой вакуумной обработки 10 минут. После вакуумной обработки замените очищающий раствор. Чтобы облегчить очистку семян, поместите центрифужную трубку защищенной от света на 30 минут до семи дней при комнатной температуре.
В случае поздних эмбрионов ежедневно заменяйте раствор свежим очищающим раствором, после чего подвергайте семена вакуумной обработке в течение 10 минут. Поместите очищенные семена на горку или один вогнутый слайд. Используя микроскоп DIC, оснащенный цифровой камерой, регулируйте и оптимизируйте яркость пропускаемого света, ползунок DIC и диафрагму конденсатора в режиме реального времени для каждого образца и захватывайте изображение.
При традиционном методе очистки семян S.lycopersicum плотные клетки эндосперма блокировали визуализацию ранних эмбрионов при 3 и 6 DAF. Снижение проницаемости во время роста семян приводило к нечетким изображениям после 9 DAF. Слизь семян и оболочка семян постепенно становились плотнее, предотвращая проникновение очищающих агентов от 13 DAF и далее.
Контур эмбриона внутри 14-19 семян DAF был чрезвычайно размытым, несмотря на увеличенное время обработки в семь дней. Внутренняя структура в 22 семенах DAF была совершенно невидимой. Зачищенная слизь семенной оболочки, полученная эпидермальными клетками семенной оболочки, была заметна начиная с 13 DAF и далее.
Обработка гипохлорита натрия позволила четко идентифицировать внутреннюю оболочку семян и отслоить большую часть адгезивной слизи без повреждения семян. В оптимизированном протоколе очистки семена показали удовлетворительную прозрачность на всех проверенных стадиях развития. Наблюдались отчетливые клеточные слои семенной оболочки при 3 DAF, различимые клетки эндосперма при 5 DAF, палочковидный эмбрион при семи DAF, шаровидная стадия при 9 DAF и стадия сердца при 11 DAF.
В оптимизированном протоколе степень скручивания семядолий и стреляющей апикальной меристемы очень легко фиксировалась на различных стадиях эмбрионального развития. Стерилизация удаляет слизь семян и пигмент семенной оболочки, которые улучшают проникновение семян и визуализацию. Вакуумная обработка может ускорить проникновение очищающего раствора.
