Значимость протокола заключается в его удобстве в сжатые сроки, необходимые для его завершения. Это обеспечивает высокую пропускную способность, высокую концентрацию и высокую степень изоляции черешковых и сидячих трихом. Главным преимуществом этой методики является ее прямолинейность.
Во время этого метода следует учитывать плотность трихомы растительного источника и проверять степень изоляции на каждом этапе с помощью микроскопа при первом выполнении протокола. Продемонстрирует эту технику Нурит Шалев, эксперт по каннабису из Центра Вулкани. Начните с измельчения блока сухого льда на мелкие мелкие хлопья с помощью молотка и твердого плоского предмета в пятилитровом пластиковом контейнере.
Используйте большое ситечко и просейте мелкие хлопья сухого льда из неизмельченного сухого льда в другой пятилитровый пластиковый контейнер. Насыпьте примерно 200 кубических сантиметров хлопьев сухого льда в вертикальный литровый стеклянный стакан. На первый слой измельченного сухого льда добавьте до 10 граммов замороженных соцветий конопли и покройте его дополнительным слоем из 200 кубических сантиметров мелко измельченного сухого льда.
Затем накройте отверстие литрового стеклянного стакана двумя-тремя слоями одномиллиметровой дверной москитной сетки и закрепите его резинками. Затем налейте жидкий азот в большую емкость из нержавеющей стали с круглым дном. Вставьте сетку размером 350 микрометров в просеиватель муки или ситечко, чтобы покрыть сетку просеивателя муки снизу.
Поместите этот просеиватель муки над большим контейнером из нержавеющей стали с круглым дном, заполненным жидким азотом. Чтобы свести к минимуму потери просеянной массы, следите за тем, чтобы ширина емкости превышала ширину просеивателя муки. Отделите трихомы от растительного материала, встряхнув стакан объемом в один литр так, чтобы его отверстие было направлено вниз к просеивателю муки.
Откладывайте стакан каждые две-три минуты, позволяя просеивать измельченный сухой лед и растительный материал, скопившийся на мучном сите. Просейте сито для муки горизонтально, чтобы облегчить прохождение растительного материала в жидкий азот в контейнер из нержавеющей стали с круглым дном, расположенный ниже. Затем добавьте жидкий азот в контейнер из нержавеющей стали и измельченный сухой лед в литровый стеклянный стакан, когда их уровень закончится.
Когда растительный материал на мучном сите истощится, заправьте использованный растительный материал в стеклянный стакан дополнительными 10 граммами свежего растительного материала и повторите процесс просеивания до тех пор, пока в контейнер не соберется достаточное количество обогащенных трихом. Проверьте наличие белого порошкообразного вещества на дне контейнера из нержавеющей стали, погруженного в жидкий азот, перед наблюдением под микроскопом, чтобы подтвердить сбор достаточного количества трихом. Добавьте небольшое количество жидкого азота в чистый небольшой контейнер из нержавеющей стали с круглым дном.
Затем сложите микросито размером 40 на 40 сантиметров с размером ячеек 150 микрометров дважды, чтобы получить складку размером 20 на 20 сантиметров, и откройте его в форме конуса. Прикрепите сетчатый конус к краю контейнера из нержавеющей стали с круглым дном с помощью одной или двух прищепок так, чтобы открытая часть конуса находилась в вертикальном положении, а его заостренная часть была частично погружена в жидкий азот. После этого аккуратно вылейте жидкий азот, содержащий полученное ранее белое порошкообразное вещество, в конус микросита.
Используя широкую щетку, соберите и перенесите оставшийся растительный материал из первого контейнера в конус с ячейкой 150 микрометров. Затем осторожно отсоедините прищепку от крышки контейнера и откройте конус микросита, чтобы найти трихомы в середине открытого микросита. Держите все четыре угла микросита вместе и погрузите среднюю часть, содержащую трихомы, в жидкий азот.
Аккуратно окуните и встряхните микросито в жидком азоте в течение одной минуты. Используя стерильную иглу, сделайте крошечные отверстия в крышке 50-миллилитровой пробирки, чтобы избежать повышения давления. Зачерпните непросеянные растительные остатки, сухой лед и более крупные трихомы, завернутые в центр микросита, в 50-миллилитровую пробирку и храните ее при температуре минус 80 градусов по Цельсию для будущего использования.
Просеянные трихомы, погруженные в жидкий азот, перемещают последовательно через микросита, уменьшая размеры заливки со 105 до 80 до 65, а затем до 50 микрометров. После каждого переноса собирайте трихомы разного размера, оставшиеся на микросите, отдельно и маркируйте их. Сделайте крошечные отверстия в колпачке пробирки с помощью стерильной иглы.
Перенесите желаемые трихомы, погруженные в жидкий азот и завернутые в микросито 50 микрометров, на чистую тарелку с помощью предварительно охлажденной ложки. Затем быстро переложите порошкообразные трихомы в маркированную предварительно охлажденную 1,5-миллилитровую пробирку с помощью предварительно охлажденного шпателя и сразу же храните пробирки при температуре минус 80 градусов по Цельсию для дальнейших исследований. На начальной стадии процесса выделения в изолированной части преобладали кусочки ткани листа, в отличие от конечного продукта изоляции, который полностью состоял из незагрязненных изолированных трихом.
Качество изолированных зернистых головчатых черешков и сидячих трихом наблюдалось на заключительном этапе выделения. Чистота трихом, выделенных с помощью этого метода, была сопоставима с обычным протоколом. Тонкая структура черешковой трихомы была сохранена, и были видны целые головки изолированного стеблевого трихома, в отличие от традиционного метода, где отсутствовала полная структура головки трихомы и присутствовали только клетки диска.
Выделение РНК и оценка целостности РНК изолированных трихом показали высокое число целостности РНК или значения RIN от 9,4 до 10, а гель-хроматография показала высокую целостность РНК. Осторожно выполните Т-образное инфузионное движение изоляции от 150 до 50 микроситетов. Этот метод может дать представление о транскриптомном и, вероятно, протеомном составе трихом из каннабиса и трихом других видов растений.
После этой процедуры могут быть выполнены метаболические и транскриптомные характеристики. Эти дополнительные методы могут помочь понять уровни экспрессии генов в изолированных трихомах и их метаболические профили. Этот метод позволил транскриптомно охарактеризовать железистые трихомы из разных сортов каннабиса.
