Два метода фенотипического анализа, представленные здесь, предлагают высококачественные изображения, достаточные для проведения количественного фенотипического анализа и для демонстрации фенотипических реакций на лечение пептидами с эпидермальными деталями. Следовательно, эти два метода могут быть использованы для понимания паттерна и развития эпидермальных клеток. Эти два метода являются относительно простыми и надежными методами, поскольку они не требуют каких-либо токсичных химикатов или эпидермального фрагмента, которые широко используются для эпидермального фенотипического анализа.
Однако методы сложны и требуют специальной подготовки. Для начала тщательно выберите и вырежьте одну из семядолей из отдельных саженцев, которые равномерно растут вместе с другими саженцами на тарелке, чтобы ограничить изменчивость. Поместите каждый семядоль в микроцентрифужную пробирку, содержащую один миллилитр фиксирующего раствора, с помощью щипцов и оставьте образец в фиксирующем растворе на ночь при комнатной температуре.
Удалите фиксирующий раствор и добавьте один миллилитр 70% этанола. Переверните пробирку пару раз и оставьте пробирку с образцами при комнатной температуре примерно на 30 минут. Повторите этот шаг, используя один миллилитр 50% этанола, а затем 20% этанола.
Замените один миллилитр 20% этанола одним миллилитром дистиллированной воды, несколько раз переверните пробирку с образцами семядольных и оставьте примерно на 30 минут. Удалите всю дистиллированную воду из тюбика и немедленно добавьте около 200 микролитров раствора для окрашивания Toluidine Blue O или TBO в течение примерно двух минут. Удалите окрашивающий раствор TBO как можно тщательнее, а затем сразу же промойте образцы пару раз, добавив один миллилитр свежей дистиллированной воды.
В ламинарный колпак осторожно пересадите от 10 до 12 однодневных саженцев арабидопсиса с каждой из двух подготовленных пластин в 24-луночную тарелку, содержащую 1,5 миллилитра половины жидкой среды MS в каждой лунке. Добавьте либо 50 миллимолярный буфер трис HCL, либо две разные концентрации пептида в каждую лунку, содержащую проростки, пророщенные на половине агаровых пластин MS. Аккуратно перемешайте рассаду с одним буфером или пептидным раствором с помощью пипетки и заклейте пластину микропористой лентой.
Инкубируйте пробирную пластину в условиях долгого дня в течение пяти-семи дней при температуре 22 градуса Цельсия. Перенесите саженец из лунки на покровную горку и рассеките семядоль саженца. Поместите абаксиальную сторону семядольной области вверх с помощью щипцов и разрежьте ее на небольшие кусочки.
Возьмите еще одно чистое предметное стекло микроскопа и поместите на него каплю раствора йодида пропидия. Поместите один из небольших кусочков семядольной области в каплю с помощью щипцов и аккуратно поместите покровное стекло. Нанесите дополнительный раствор йодида пропидия на край покровного стекла, чтобы удалить образовавшиеся пузырьки воздуха.
Изображение абаксиальной стороны семядольной области с помощью конфокального микроскопа и сравните изображения с изображениями сеянцев, выращенных в половине среды MS, содержащей только буфер. Здесь показаны абаксиальные семядольные изображения 10-дневных сеянцев трех генотипов Arabidopsis, дикого типа, молчаливой линии STOMAGEN и мутантов epf1 epf2. Здесь молчаливая линия STOMAGEN представляет генотипы с низким количеством устьиц, а мутанты epf1 epf2 представляют генотипы с большим количеством устьиц.
Для количественного анализа эпидермального фенотипа были использованы репрезентативные изображения эпидермиса семядолей 10-дневных проростков дикорастущего типа, тмм и трансгенных линий, несущих индуцируемую эстрадиолом конструкцию сверхэкспрессии epf2 или epf1. На этом рисунке показаны репрезентативные конфокальные изображения дикого типа и семядольного эпидермиса epf2, выращенного в течение шести-семи дней в буферном растворе, и семядольного эпидермиса epf2, выращенного с двумя различными партиями пептидов epf2. Выполняя эту процедуру, обязательно срежьте одну из семядолей с отдельного саженца, который уже равномерно растет вместе с другими саженцами.
Также выбирайте саженец, который не прикасается к среде MS, чтобы ограничить вариативность. Еще один момент, который следует помнить, заключается в том, что не помещайте более пяти семядолей в одну микроцентрифужную пробирку. Кроме того, аккуратно проведите по тюбику, чтобы обеспечить равномерное распределение пятен TBO вокруг семядолей, чтобы они хорошо окрашивались.
Учитывая, что в пептидном растворе существует несколько структурных пептидов, этот метод биоанализа будет очень полезен для идентификации правильно сложенных и биологически активных форм пептида и их биологических функций.
