Наш безэкзогенный метод выделения и экстракционной экспансии стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека, является ответом на проблемы биобезопасности, связанные с клеточной терапией, когда она рассматривается для трансляционного применения. Наши методы изоляции и расширения просты в воспроизведении, быстры и не требуют технических требований, что делает их полезными для всех. Мы исследуем стратегию терапии на основе жировых стволовых клеток человека для восстановления периферических нервов.
Тем не менее, наш метод может широко применяться, когда новые жировые стволовые клетки необходимы в различных клинических исследованиях. Мы сделали его простым, чтобы сохранить более легкую технологичность. Стерильность следует тщательно наблюдать от операционной до культивирования клеток.
При манипуляциях с образцами и фрагментами микровскрытие сопряжено с риском загрязнения. После получения образца жировой ткани в результате пластики брюшной полости с помощью стерильных ножниц разрежьте его на кусочки размером примерно в один квадратный сантиметр. С помощью скальпеля микро рассеките каждый кусочек на более мелкие фрагменты и рассейте пять фрагментов в 10-сантиметровой чашке Петри.
Для прикрепления фрагмента используйте скальпель, чтобы сделать надрезы на пластиковой поверхности и перетащить каждый фрагмент. Аккуратно добавьте 10 миллилитров полной питательной среды, чтобы покрыть все фрагменты, не отделяя их, и инкубируйте чашку Петри при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Ежедневно контролируйте расширение стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека, или HASC, под оптическим микроскопом до тех пор, пока клетки не начнут сливаться.
Заменяйте среду свежей полной средой каждые 72 часа, чтобы удалить клеточный мусор и дать ему расти до первого прохода. Как только культура HASC достигнет слияния от 70 до 80%, удалите и выбросьте все кусочки ткани с помощью стерильного пинцета. Кроме того, откажитесь от отработанной среды, избегая отрыва HASC от чашки Петри.
Тщательно вымойте клетки 10 миллилитрами PBS. После удаления PBS добавьте один миллилитр трипсина, не содержащего животных, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. Проверьте отслоение клеток под оптическим микроскопом и при необходимости инкубируйте еще две минуты.
Чтобы поддержать отслоение клетки, аккуратно постучите по пластиковой поверхности. Остановите действие трипсина, добавив два миллилитра полной среды и соберите все клетки в 15-миллилитровую пробирку. Удалите оставшийся трипсин центрифугированием.
После удаления надосадочной жидкости суспендируйте клетки в пятимиллилитровой полной среде и перенесите клеточную суспензию в новую колбу Т25. Для криоконсервации подсчитайте аликвоту отделенных отделенных клеток с помощью счетчика клеток под оптическим микроскопом. Центрифугируйте клетки при 300 G в течение пяти минут.
После удаления надосадочной жидкости суспендировать клетки в замораживающей смеси с плотностью от 10 до шестой клетки на миллилитр и перенести один миллилитр клеточной суспензии в один криофлакон. Поместите криофлаконы при температуре минус 80 градусов Цельсия в контейнер для замораживания, который снижает температуру на один градус Цельсия в минуту, а затем переместите криофлаконы в жидкий азот для длительного хранения. В первоначальном виде кластера HASC показали классическую веретенообразную форму и были меньше, а также более вытянутыми по сравнению с контрольными клетками в присутствии FBS.
Клеточный иммунофенотип, по-видимому, был сходным между HASC, культивируемыми с двумя добавками. От 80 до 90% HASC были положительными на CD73 и CD105 и менее 5% экспрессированных на CD34 и CD45. Наконец, анализ пролиферации показал значительное увеличение роста клеток при добавлении лизата тромбоцитов человека в среду по сравнению с контролем FBS.
Наиболее важным этапом является микрорассечение жировых фрагментов и их прикрепление скальпелем на чашке Петри. Получена готовая к использованию популяция стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека, в соответствии с критериями биобезопасности GMP, сохраняющая терапевтические свойства клеток и усиливающая пролиферацию клеток.
