Методы, представленные здесь, полезны для изучения сообщества эндофитных грибов, ассоциированных с различными органами растений. Выделение эндофитных грибов позволяет их идентифицировать, а также ценно при других методах, таких как симбиотическое проращивание. Для начала приготовьте от восьми до 10 сантиметров питательной среды КПК чашки Петри, дополненные тремя миллилитрами на литр антибиотика.
Проверьте наличие загрязнения, инкубируя питательную среду в чашках Петри при температуре 36 градусов Цельсия в течение 24 часов перед использованием. На следующий день поверхностно дезинфицируют здоровые михогетеротрофные фрагменты растений по стандартной процедуре и помещают их в стерильную чашку Петри. Для оценки эффективности поверхностной дезинсекции образцов посев нескольких капель дистиллированной воды, использованной во время последней промывки образцов на КПК.
Затем с помощью пламенного скальпеля и щипцов разделите образцы на кусочки толщиной 0,2 сантиметра. Разделите образцы, чтобы увеличить площадь поверхности, контактирующей со средой. Поместите пять фрагментов подземных органов в планшет с ОАП с антибиотиком как можно дальше друг от друга, не касаясь краев чашки.
Запечатайте чашки Петри пищевой пленкой и храните их в темноте при температуре от 25 до 27 градусов Цельсия в течение пяти дней. За сутки до субкультивирования приготовьте пятисантиметровые чашки Петри, используя пять-семь граммов на литр АА-среды, и инкубируйте пластины при температуре 36 градусов Цельсия в течение 24 часов. Чтобы очистить грибковые изоляты, дифференцируйте колонии пластин PDA по цвету, характеру роста, текстуре и формату краев.
Затем разграничите края колоний на нижней стороне посуды. Также идентифицируйте колонии с помощью кода. Используя кончик автоклавной деревянной зубочистки, извлеките небольшое количество мицелия из краев идентифицированной грибковой колонии и исчеркните пластину AA, образовав три полосы на расстоянии одного сантиметра друг от друга и краев чашки.
Наклейте на табличку АА соответствующий код с помощью бумаги для наклеек и карандаша. Перед инкубацией в темноте запечатайте пластины при температуре от 25 до 27 градусов Цельсия в течение трех дней. После инкубации внимательно наблюдайте за пластинами, чтобы выявить тонкие гифы, образующие отдельные колонии.
Разграничьте площадь отдельных колоний с помощью перманентного маркера. Отрежьте часть среды, содержащей колонию, с помощью автоклавной зубочистки, и перенесите срезанный объем в центр новой планшета Петри КПК без антибиотиков. После маркировки чашек Петри кодами изолятов запечатайте их пищевой пленкой и выдержите в темноте при температуре от 25 до 27 градусов Цельсия в течение семи-14 дней.
Чтобы начать консервацию грибковых изолятов по методу Кастеллани, добавьте 0,5 миллилитра дистиллированной воды в автоклавную двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку. С помощью автоклавной зубочистки срежьте 0,5 на 0,5 сантиметра кубовидную среду от краев мицелия уже выращенных очищенных изолятов. Поместите от четырех до шести кубоидов в пробирки микроцентрифуги с дистиллированной водой.
Храните пробирки в темноте при температуре 25 градусов Цельсия столько, сколько потребуется. При необходимости восстановите кубоид и поместите его в центр новой чашки КПК, чтобы вырастить хранящийся изолят. Начните метод дразнящего монтажа, поместив каплю пятна Toluidine blue-O на чистое предметное стекло.
В такой технике можно использовать разные морилки. С помощью автоклавной зубочистки аккуратно удалите несколько гиф из выращенного изолята, и поместите их в каплю пятна. Поместите обложку и проанализируйте ее под световым микроскопом.
Для способа крепления клейкой лентой поместите каплю лактофеноловой хлопковой синей морилки на чистое предметное стекло. Отрежьте полоску прозрачной клейкой ленты по размеру, который подходит к предметному стеклу и центральному пятну хорошо капли. Направьте липкую поверхность клейкой полоски на поверхность мицелия и попытайтесь собрать несколько гиф, не нажимая и не собирая их слишком много.
Затем приклейте ленту к предметному стеклу, убедившись, что пятно соприкасается с собранными гифами. Поместите каплю воды на ленту и поместите покровный листок, прежде чем анализировать предметное стекло под световым микроскопом. Рост небольших групп мицелия нитчатых грибов, выходящих из внутренней части фрагментов, наблюдался после пятидневного посева михогетеротрофного фрагмента органа растения на среду ФДА.
В течение 7-14 дней инокуляции очищенного изолята на КПК наблюдался центробежный рост чистой колонии грибного изолята, образующей единственный кольцевой мицелий. Возможные загрязнения были легко идентифицированы, что нарушало однородность колонии в отношении формы роста, цвета и продукции пигмента в среде. Колония, выделенная из веретенообразных корней михогетеротрофной орхидеи Wullschlaegelia aphylla, была непрозрачной, без диффузных пигментов или экссудата в среде.
Колония была от беловатой до серой с верхней стороны и буроватой с нижней. Мицелий был воздушным и обильным, а края неправильными и воздушными. Колония имела бархатистую текстуру и морщинистый рельеф без макроскопических структур.
Структуры, которые были плохо видны в неокрашенном мицелии, были обнаружены после окрашивания мицелия гриба лактофенолом хлопковым синим и толуидином синим-О, что облегчало их идентификацию. Представленные здесь методы выделения грибов могут быть применены и к зеленым растениям для идентификации эндофитов грибов. Изолированные грибы могут быть использованы в симбиотических испытаниях по проращиванию.
